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摘要：在固相多肽合成中, 探索一種經濟有效的Boc保護氨基酸鍵合氯甲基樹脂的方法.采用K?CO?/KI作為鍵合試劑, 一步合成產物, 反應條件為:Boc保護氨基酸2.5倍量, K?CO?2.5倍量, KI0.01倍量, 氯甲基樹脂1.0倍量, 普通DMF作反應溶劑, 70℃空氣浴中旋轉反應25h.考察了28種不同結構的氨基酸底物在此條件下與氯甲基樹脂的鍵合收率, 大多數氨基酸都能得到幾乎定量的酯化產率.并選取了不同空間位阻的4種Boc保護氨基酸, 比較了KOH, Cs?CO?, TEA/KI, DCHA/KI, DIPA/KI, Cs?CO?/KI和K?CO?/KI等不同鍵合條件對收率的影響.結果表明, 除Boc-Asn-OH外, K?CO?/KI條件與Cs?CO?/KI的效果大體相同, 但K?CO?/KI更為經濟、可行. 關鍵詞： Boc保護氨基酸 氯甲基樹脂 (Merrifield樹脂) 固相合成 多肽 1963年Merrifield創造了固相多肽合成 (solidphase peptide synthesis, SPPS) 技術, 經過40多年的發展, 現在已經成為多肽合成以及組合化學合成的重要手段, 許多液相的有機反應被引入固相合成領域, 并引起人們的廣泛關注.作為SPPS中的第一步, 即將第一個氨基酸的羧基通過酯鍵或酰胺鍵連接到樹脂上, 是固相合成的重要組成部分, 其連接效率的高低不但直接影響到最終合成目標多肽的產率和純度, 而且對下一個氨基酸的用量具有重要的指導作用[1], 從而進一步影響整個反應的合成成本.因此對固相多肽合成中第一步的鍵合方法及效率研究相當關鍵. 氯甲基樹脂 (Merrifield樹脂) 是固相反應中常用也是最經濟的載體, 它主要與氨基酸或其它有機酸的羧基通過形成芐酯進行鍵合, 該反應必須在堿催化下完成, 反應式如Eq.1.  我們在大量的合成實驗研究中發現, 已有文獻報道的方法都各有不足之處, 通常的反應條件如三乙胺 (triethylamine, TEA) 催化的收率較低[2];冠醚條件及Cs?CO?催化成本均較高, 不宜放大生產[3];常規的鉀鹽法需要進行預制并需嚴格無水條件, 因此有必要探索一種更有效、更實用的新方法.本文報道的新的Boc保護氨基酸鍵合氯甲基樹脂的方法, 無需預制, 并通過對28種不同結構的天然與非天然氨基酸的應用考察, 證明其確實是一種簡便、經濟、高效的合成方法, 特別適用于大規模的研發和生產.而且我們還以具有代表性的不同側鏈位阻的4種Boc保護氨基酸為例, 將該方法與文獻報道的其它方法進行了比較, 綜合結果表明該方法更為實用、可行. 1 結果與討論Boc保護策略是經典的多肽固相合成方法.雖然Boc方法正逐漸被Fmoc方法所替代, 但是其本身的優點還是不容忽視, 有些方面值得我們借鑒和應用.與Fmoc方法相比, Boc法更經濟.此外, 每次去除α-氨基保護基時使用的三氟乙酸 (trifluoroacetic acid, TFA) 會徹底地清除樹脂網格內積存的難溶的副產物N, N'-二環己基脲 (DCU) .TFA還會解除肽鏈的β-折疊, 可以減弱二級結構對合成難度的負面影響[4].Fmoc方法則過度依賴于肽序列, 并且不能完全去除α-氨基的保護基[5, 6], 為了克服此不足, 必須用20%哌啶/二甲基甲酰胺 (N, N-Dimethylformamide, DMF) (V/V) 溶液脫除兩次, 有的個別序列還要延長反應時間.而且, Boc保護氨基酸與Merrifield樹脂的成酯效率明顯高于Fmoc保護氨基酸與Wang樹脂的成酯反應[7], 這將極大影響最終肽產品的產量, 從而降低多肽的合成成本.還應指出的是, 當目標肽的C端為沒有側鏈保護的殘基如Ala, Gly, Leu, Ile, Phe, Tyr, Ser, Thr, Val時可以用本文的條件進行與氯甲基樹脂鍵合.隨后的序列組裝完全可以用Fmoc保護的氨基酸進行手工或儀器合成.這樣兼顧了Boc與Fmoc兩種方式的優勢, 使固相肽合成變得更經濟、可行. 在Boc策略中, C-端羧基肽合成常采用的樹脂的功能基團為氯代甲基衍生物, 與Boc保護氨基酸的羧基或羧酸鹽反應, 形成酯鍵, 將第一個保護氨基酸鍵合到樹脂上, 常用的方法主要有:叔胺鹽法、鈉鹽法、鉀鹽法和銫鹽法, 常用的堿試劑有Cs?CO?, KOH, TEA, KF等. 1.1 不同氨基酸與氯甲基樹脂的鍵合 采用“一鍋法”制備Boc保護氨基酸樹脂:用K?CO?代替文獻中常用的較昂貴的銫鹽, 并在反應時, 加入少量KI催化使反應更容易進行.反應所用的溶劑DMF為市售分析純, 無需處理. 10.0 g氯甲基樹脂 (取代度為0.53 mmol/g) 經上述方法處理后的增重 (?W) , 氮含量及平均轉化率結果見表1. 銫鹽法是文獻[8]報道最有效的方法之一, 但此方法也存在一些不足.首先, 在氯甲基樹脂與第一個氨基酸進行鍵合時, 反應中加入的固體Cs?CO?與氯甲基樹脂、保護氨基酸的羧基組分在DMF溶劑中形成了三相反應體系, 使得反應物相互不能充分接觸, 而影響了反應的進行;再者, 反應結束后需要用水將銫鹽除去, 由于銫鹽水溶液的堿性, 使鍵合后的樹脂有發生水解的可能性;常規的銫鹽法還需要進行預制[9], 先將保護的氨基酸或肽與Cs?CO?或Cs HCO?溶于水及甲醇中, 全溶后減壓蒸干, 然后用甲醇或甲苯溶劑反復減壓蒸干至無水而得到相應的保護氨基酸的銫鹽, 再與氯甲基樹脂進行鍵合反應;改進的銫鹽法[3]省去了預制, 雖實際產率多數較為滿意, 但Cs?CO?本身對于反應條件要求還是比較苛刻, 如樹脂的質量、溶劑的純凈度等, 增加了反應成本和操作難度, 降低了縮合的成功率;另外, 固體Cs?CO?易于潮解、結塊以致失效, 而且價格昂貴, 大約是K?CO?售價的400倍多, 放大工藝操作可行性差.采用K?CO?/KI方法, 則排除了上述缺點, 即使反應溶劑中含有的少量水分和雜質也不會對反應產生影響, 大多數氨基酸都能得到幾乎定量的酯化產率 (表1) . 文獻[10]報道的鉀鹽法, 也需要進行較繁瑣的保護氨基酸鉀鹽的預制, 然后經過P?O?干燥劑反復嚴格地無水處理, 再將所得無水的保護氨基酸鉀鹽與氯甲基樹脂反應, 最終獲得80%左右的酯化產率, 殘余氯量約為7%, 有時可能會導致少量醛基的生成, 必要時還需要加入18-冠-6以減少副產物.基于不同的鹵代芐在親核取代 (SN) 反應中的活性不同的原理, 本文在K?CO?條件下進行鍵合, 反應中加入KI作為催化劑, 大大提高了反應物活性和酯化的產率 (表1) , 而且無需預制.其機理可能是, 在以氯芐型的氯甲基聚苯乙烯樹脂為原料的鍵合反應中, 首先與KI發生鹵交換反應形成了較活潑的碘芐, 從而增強了中間體的反應性. 表1 K?CO?/KI對不同氨基酸與氯甲基樹脂鍵合收率  1.2 不同條件下Boc保護氨基酸與氯甲基樹脂的鍵合效率比較 本文選取了具有代表性的不同空間位阻的氨基酸, 進行不同條件下鍵合效率的研究.側鏈位阻大小不同的幾種Boc保護氨基酸在不同條件下鍵合效率比較結果見表2.  文獻曾采用多種有機堿催化Boc保護氨基酸的芐酯化反應, 如TEA, 二乙胺 (diethylamine, DEA) , 二環己胺 (dicyclohexylamine, DCHA) , N-芐基三甲基氫氧化銨 (Triton B) 等.采用TEA方法的嚴重缺點是反應過程中TEA將同苯環上的氯甲基反應形成季銨, 這不僅會使未反應的氨基酸以鹽的形式結合在樹脂上而影響對已固定氨基酸的測定, 而且產生的季銨陽離子還會影響肽鍵在樹脂上的穩定性, Asn還可能發生醇解或脫酰胺反應.其中效果較好的DCHA, Triton B也僅能得到中等收率的芐酯產物.我們曾采用二異丙基胺 (diisopropylamine, DIPA) 及N-甲基嗎啉 (4-methylmorpholine NMM) [2]作為N-保護的氨基酸與氯甲基樹脂鍵合的反應試劑, 雖然收率有所提高, 但也低于本文的K?CO?/KI方法. 從表2可以看出, 4種Boc保護氨基酸底物中除了Boc-Asn-OH以外, 均可在K?CO?/KI條件下獲得收率很高的樹脂芐酯產物.Asn屬于20種天然氨基酸中非常特殊的氨基酸, 空間位阻較大, 其分子內的酰胺基在合成肽及有關反應中往往脫去一分子H?O生成腈類副產物或易形成氫鍵導致分子間高度締合而溶解度下降[11]。因此, 現有的方法中只有Cs?CO?/KI能獲得較高的收率也只有76.5%.如何進一步提高Asn與樹脂的鍵合效率還是一個亟待解決的難題. 綜上所述, 用K?CO?代替目前常規采用的較昂貴的銫鹽, 并在反應時, 加上少量的KI催化, 除了Boc-Asn-OH外, K?CO?/KI條件與Cs?CO?/KI的效果大體相同, 但K?CO?/KI條件無需預制氨基酸鉀鹽, 溶劑DMF為工業級、不用干燥, 操作簡便, 成功率高.因此本文采用的工藝條件更為價廉、可行. 1.3 重量法與元素分析法測定鍵合收率的比較 采用重量法和元素分析法分別測定Boc保護氨基酸與氯甲基樹脂的鍵合產率, 并據此計算酯化平均收率.結果表明兩種方法測得的收率非常吻合, 因此, 重量法也是測定鍵合收率的可行方法之一, 而且重量法更方便、易行.僅需準確稱出樹脂的投料量和合成產物的重量, 就可以計算出酯化收率.而其它方法操作步驟較為繁瑣, 且需要特制的裝置或專門的儀器設備. 免責聲明：本文為行業交流學習，版權歸 原作者所有，如有侵權，可聯系刪除。 參考文獻：https:///Jwk_yjhx/CN/Y2007/V27/I04/536 |
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