多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾方法

摘要: 聚乙二醇是一類具有獨(dú)特理化性質(zhì)的大分子聚合物.多肽和蛋白質(zhì)類藥物經(jīng)聚乙二醇共價(jià)修飾后能明顯改善其藥代學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)，如降低免疫原性、增加對(duì)蛋白水解酶的穩(wěn)定性、增加水溶性及延長體內(nèi)的半衰期等.蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾研究已取得較好的效果，多肽的聚乙二醇化修飾研究起步較晚.對(duì)近年來多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾方法進(jìn)行了綜述，主要介紹了對(duì)多肽和蛋白質(zhì)的N端、C端及某些氨基酸側(cè)鏈進(jìn)行選擇性聚乙二醇化修飾的方法.

關(guān)鍵詞: 聚乙二醇，聚乙二醇化修飾，多肽，蛋白質(zhì)

聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)是一類具有獨(dú)特理化性質(zhì)的大分子聚合物，它具有良好的水溶性，也能溶于二氯甲烷、N'N'-二甲基甲酰胺、苯、乙腈和乙醇等有機(jī)溶劑.聚乙二醇由環(huán)氧乙烷聚合而成，通過控制反應(yīng)條件可得到平均分子量由幾百到幾萬的聚合物.普通的聚乙二醇分子兩端各有一個(gè)羥基，若一端以甲基封閉則得到單甲氧基聚乙二醇(monomethoxypolyethylene glycol,mPEG).在多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾(pegylation)研究中應(yīng)用最多的是mPEG的衍生物.

蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾研究始于二十世紀(jì)七十年代，最初的目的主要是為了降低蛋白質(zhì)類藥物的免疫原性.進(jìn)一步的研究表明，蛋白質(zhì)經(jīng)聚乙二醇化修飾后還可以改善許多其它方面的性質(zhì)，如增加蛋白質(zhì)對(duì)酶的穩(wěn)定性、延長蛋白質(zhì)在血漿中的半衰期、增加在水中的溶解度等l1~3].一些蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾物在作為藥物的應(yīng)用中取得了較好的效果.1991年，第一種經(jīng)聚乙二醇化修飾的蛋白質(zhì)類藥物PEG-腺苷脫氨酶被FDA批準(zhǔn)上市,用于治療一種嚴(yán)重的兒童免疫缺陷癥.2001年，用聚乙二醇修飾的干擾素(PEG-INTRON)經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市,用于治療慢性丙型肝炎.多肽與蛋白質(zhì)在理化性質(zhì)上具有許多相似之處，肽類化合物的聚乙二醇化修飾研究晚于蛋白質(zhì)的相關(guān)研究，近年來關(guān)于肽類化合物的聚乙二醇化修飾研究也取得了一些進(jìn)展，尤其是肽類化合物在聚乙二醇化定點(diǎn)修飾方面較蛋白類物質(zhì)更易于實(shí)現(xiàn)，因此開展肽類化合物的聚乙二醇化修飾研究也具有較重要的意義.

在多肽的聚乙二醇化修飾研究中應(yīng)用最普遍的是mPEG,先在mPEG的末端引入羧基、氨基或其它活性基團(tuán)，或者制備經(jīng)mPEG修飾的氨基酸衍生物，再利用固相或液相法將其偶聯(lián)到肽序列中去，實(shí)現(xiàn)對(duì)多肽的N端，C端及某些氨基酸側(cè)鏈的聚乙二醇化修飾.下面主要介紹近年來文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化定點(diǎn)修飾的一些方法.

1 多肽和蛋白質(zhì)中氨基的聚乙二醇化修飾方法

在多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾方法中，主要是對(duì)N末端或賴氨酸側(cè)鏈氨基進(jìn)行酰化修飾.因?yàn)榈鞍捉Y(jié)構(gòu)中通常存在多個(gè)氨基，所以控制和確定修飾位點(diǎn)及修飾程度一直是蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾中的一個(gè)難點(diǎn).肽類化合物的合成中可以通過采用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)策略來實(shí)現(xiàn)對(duì)氨基的定點(diǎn)修飾.

1.1 N端氨基的酰化修飾

為了實(shí)現(xiàn)對(duì)肽鏈中氨基的聚乙二醇化酰化修飾，需要在聚乙二醇上首先引入羧基或活化的羰基.1993年，Lu等[7]首先報(bào)道了在固相多肽合成中應(yīng)用單甲氧基聚乙二醇的羧基衍生物對(duì)肽鏈的N端氨基進(jìn)行酰化修飾的方法：以mPEG作原料，先合成mPEG—OCH?COOH和mPEG-OCH?CO—Nle-OH,在mPEG中引入一個(gè)正亮氨酸(NIe)作為標(biāo)記是為了便于確定每一個(gè)多肽分子上偶聯(lián)了幾個(gè)mPEG分子.應(yīng)用Fmoc固相多肽合成法，先在樹脂上合成全保護(hù)肽鏈，當(dāng)游離出N末端氨基后，以BOP作縮合劑，將mPEG-OCH?CO—Nle-OH作為一個(gè)單體偶聯(lián)到肽鏈上，然后經(jīng)三氟乙酸裂解和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化得到了平均分子量分別為2000和5000的mPEG修飾N-端的4肽、8肽和12肽，mPEG修飾產(chǎn)物在RP-HPLC分析圖譜上呈單一峰，結(jié)構(gòu)經(jīng)MALDT-TOF-MS分析得到確證.研究還表明，聚乙二醇對(duì)三氟乙酸處理穩(wěn)定，但氟化氫處理時(shí)會(huì)有部分?jǐn)嗔眩蚀朔ú贿m用于Boc固相多肽合成法(Eq.1).

雖然mPEG—OH與琥珀酸酐反應(yīng)可以很容易地得到mPEG—OCOCH?CH?COOH,但此分子中含有對(duì)酸和堿都不太穩(wěn)定的酯鍵，不適合用于固相多肽合成中.若通過mPEG一NH?與琥珀酸酐反應(yīng)引入羧基得到mPEG—NHCO-CH?CH?COOH,此類分子具有較好的穩(wěn)定性，適用于固相多肽合成中.mPEG—NH?可通過購買商品化試劑獲得，也可以由mPEG—OH作原料合成.在mPEG—OCH?COOH的合成中應(yīng)用了丁基鋰，反應(yīng)需在絕對(duì)無水條件下進(jìn)行，而mPEG—NHCOCH?CH?COOH的合成比較容易些(Scheme 1).

Lee等[9]以平均分子量為5000的單甲氧基聚乙二醇甲酰琥珀酰亞胺(SC-mPEG)在弱堿性水溶液中(pH=8)修飾鮭降鈣素(sCT),經(jīng)RP-HPLC分離得到N端、Lys11和LysI?側(cè)鏈氨基分別被聚乙二醇酰化修飾的三種產(chǎn)物，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)經(jīng)酶解和質(zhì)譜分析得到確證，它們?cè)诖笫竽I臟勻漿中的半衰期分別為125.5,157.3和281.5min,比sCT在大鼠腎臟勻漿中的半衰期(4.8min)顯著增加.用相同的方法，Lee等以平均分子量為3400的SC-mPEG對(duì)表皮生長因子(EGF)進(jìn)行修飾，經(jīng)RP-HPLC分離到N端、Lys2?和Lys??側(cè)鏈氨基分別被聚乙二醇酰化修飾的三種產(chǎn)物.生物活性測定表明，N端修飾產(chǎn)物活性高于Lys2?和Lys??側(cè)鏈修飾產(chǎn)物.

C-mPEG及其類似物在蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾中應(yīng)用較多，反應(yīng)條件容易實(shí)現(xiàn)，一般在弱堿性的水溶液中進(jìn)行.控制蛋白質(zhì)和SC-mPEG的比例可以得到單聚乙二醇化修飾的產(chǎn)物，產(chǎn)物的純化方法也比較簡便，可用透析、電泳及凝膠色譜等常用方法實(shí)現(xiàn).由于SC-mPEG對(duì)游離氨基沒有選擇性，當(dāng)有多個(gè)氨基時(shí)，往往難以實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)的聚乙二醇化修飾，分析和確定產(chǎn)物中聚乙二醇的修飾位點(diǎn)也較難(Eq.2).

1.2 賴氨酸側(cè)鏈氨基的酰化修飾

Lu等報(bào)道以mPEG羧基衍生物修飾賴氨酸側(cè)鏈氨基得到Fmoc-Lys(mPEG-OCH?CO)-OH,在固相多肽合成中將其作為一個(gè)單體偶聯(lián)到肽鏈中去，實(shí)現(xiàn)聚乙二醇對(duì)肽鏈中特定賴氨酸側(cè)鏈氨基的聚乙二醇化修飾.也可以在固相合成過中用烯丙氧羰基(Alloc)保護(hù)特定位置的賴氨酸側(cè)鏈氨基，肽鏈組裝完畢后先脫除Alloc,再將mPEG-OCH?COOH偶聯(lián)到賴氨酸側(cè)鏈氨基上去.然后經(jīng)三氟乙酸裂解、RP-HPIC純化可得到對(duì)肽鏈中特定賴氨酸側(cè)鏈氨基進(jìn)行聚乙二醇化修飾的產(chǎn)物.此法適用于Fmoc固相多肽合成法中對(duì)賴氨酸的定點(diǎn)聚乙二醇化修飾(Scheme 2).

1.3 N端氨基的烷基化修飾

Kinstler等用聚乙二醇的醛基衍生物(mPEG-CHO)修飾rhG-CSF.反應(yīng)在pH為5.0的水溶液中進(jìn)行，活潑的醛基可將聚乙二醇偶聯(lián)到蛋白質(zhì)分子的氨基上，同時(shí)以氰基硼氫化鈉作為還原劑實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的烷基化修飾.此法具有較好的選擇性，主要是修飾蛋白質(zhì)的N末端氨基.其溫和的反應(yīng)條件適用于固相或液相多肽合成，此法若應(yīng)用于多肽的N端氨基修飾可能也會(huì)取得較好的效果(Eq.3).

Lu等以mPEG-NH?作原料修飾天冬氨酸側(cè)鏈羧基得到Fmoc-Asp(mPEG—NH)-OH,將其用到固相多肽合成中實(shí)現(xiàn)聚乙二醇對(duì)肽鏈中天冬氨酸側(cè)鏈羧基的修飾.也可以在合成過程中用烯丙基(Allyl)保護(hù)特定位置的天冬氨酸側(cè)鏈羧基，肽鏈組裝完畢后在固相上先脫除Allyl,再將mPEG-NH?偶聯(lián)到天冬氨酸側(cè)鏈羧基上，實(shí)現(xiàn)對(duì)肽鏈中特定天冬氨酸側(cè)鏈羧基的聚乙二醇修飾.此法適用于Fmoc固相多肽合成法中對(duì)天冬氨酸或谷氨酸的定點(diǎn)聚乙二醇化修飾(Scheme3).

在固相多肽合成中，若先將Fmoc—NH-PEG—COOH偶聯(lián)到樹脂上，再合成肽鏈，最后用三氟乙酸裂解，可以實(shí)現(xiàn)肽鏈C末端羧基的聚乙二醇化修飾.

3 多肽和蛋白質(zhì)中巰基的聚乙二醇化修飾方法

Campbel等在生長激素釋放因子(GRF)類似物的C端引入半胱氨酸，在mPEG上引入巰基吡啶，然后通過二硫鍵交換實(shí)現(xiàn)mPEG對(duì)GRF類似物C端的修飾(Eq.4).

Vanwetsswinkel等用定點(diǎn)突變法在蛋白質(zhì)中引入半胱氨酸，以mPEG-MAL作為聚乙二醇化試劑，通過蛋白質(zhì)上的巰基加成到mPEG-MAL的雙鍵上實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的定點(diǎn)修飾，此法已在許多蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾中取得了良好的效果.mPEG-MAL可通過商品化試劑買到，也可以用mPEG-NH?為原料合成[17].若在肽鏈中引入半胱氨酸，也可以實(shí)現(xiàn)此類反應(yīng)(Scheme 4).

近年來，蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾方法發(fā)展很快，為多肽的聚乙二醇化修飾提供了不少新思路.Wylie等通過控制pH值實(shí)現(xiàn)SC-mPEG選擇性修飾蛋白質(zhì)中的組氨酸側(cè)鏈的咪唑基.Sato用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase,TGase)將mPEG-NH?轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的谷氨酰胺側(cè)鏈上，實(shí)現(xiàn)對(duì)谷氨酰胺的選擇性修飾.借鑒這些方法，也有可能實(shí)現(xiàn)對(duì)肽鏈中組氨酸和谷氨酰胺側(cè)鏈的選擇性聚乙二醇化修飾(Eq.5).

隨著蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾技術(shù)的迅速發(fā)展，肽類化合物的聚乙二醇化修飾研究越來越引人注目.蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾幾乎都在水溶液中進(jìn)行，通過選擇合適的聚乙二醇化試劑或控制反應(yīng)條件來實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)、定量修飾.肽類化合物的聚乙二醇化修飾可在固相載體上進(jìn)行，此法易于實(shí)現(xiàn)對(duì)多肽鏈中某位點(diǎn)的選擇性修飾，但固相合成反應(yīng)速度慢，且隨著聚乙二醇或多肽分子量增加，修飾難度增大；肽類化合物的聚乙二醇化修飾也可以在水溶液中進(jìn)行，可以實(shí)現(xiàn)分子量較大的聚乙二醇對(duì)分子量較大的多肽的修飾，但若有多個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)時(shí)產(chǎn)物分離及修飾位點(diǎn)的確定都有較大的難度.多肽和蛋白質(zhì)類化合物經(jīng)聚乙二醇化修飾后具有降低免疫原性、增加水溶性、顯著延長其在生物體內(nèi)的半衰期等優(yōu)點(diǎn)，但也可能因修飾而影響其與受體的結(jié)合，因此尋找合適的修飾位點(diǎn)，保持持續(xù)、有效的生物活性是多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾研究的主要目的.多肽和蛋白質(zhì)類藥物的聚乙二醇化修飾研究有較好的應(yīng)用前景.

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