生化反應(yīng)曲線你看懂了嗎

鐘金清  廈門蓮花醫(yī)院檢驗(yàn)科

在日常檢驗(yàn)工作中，利用生化反應(yīng)曲線尤其是異常曲線來尋找校準(zhǔn)失敗，質(zhì)控失控及標(biāo)本失真的原因及糾正，已經(jīng)有很多同行探討過了，也獲得了很大成果，但對于很多剛?cè)胄械耐蕘碚f，反應(yīng)曲線到底是怎么回事都不知道，更談不上利用反應(yīng)曲線來排除錯(cuò)誤了。本文就以我們科室的貝克曼dxc800生化儀的反應(yīng)曲線來給小白們科普一下到底反應(yīng)曲線是什么，怎么看反應(yīng)曲線是否異常。

生化反應(yīng)以檢測的方法學(xué)上面大概可以分兩大類：終點(diǎn)法及速率法。運(yùn)用終點(diǎn)法的項(xiàng)目包括：TP，Alb，Ua等，速率法：ALT,AST,ALP,GGT等。兩種方法又以與空白吸光度的關(guān)系分成若干個(gè)子方法，其中市面上的絕大部分生化儀多采用終點(diǎn)法2及速率法1，即：將空白吸光度從反應(yīng)吸光度中減去也就是在計(jì)算吸光度的時(shí)候首先去除了空白吸光度的影響和不將空白速率從反應(yīng)速率中減去。

生化反應(yīng)：底物A+底物B產(chǎn)物C+產(chǎn)物D，終點(diǎn)法的原理是：檢測的項(xiàng)目作為底物A或B，當(dāng)反應(yīng)到達(dá)平衡時(shí)，檢測底物的消耗量或者產(chǎn)物的生產(chǎn)量，即可用算出檢測項(xiàng)目的量。速率法的原理是：檢測的項(xiàng)目作為催化反應(yīng)的E，在保證底物A和B充足的情況下，在反應(yīng)還未達(dá)到平衡之前，檢測底物消耗的速度或產(chǎn)物生產(chǎn)的速度即單位時(shí)間內(nèi)的消耗量或生產(chǎn)量，即可算出檢測項(xiàng)目的催化活性，再換算成相應(yīng)的國際單位。

下面我們就以TP和ALT來解釋反應(yīng)曲線的來龍去脈。

上圖是某個(gè)項(xiàng)目整個(gè)檢測過程的時(shí)序圖，從中我看可以看出反應(yīng)開始都是先加入主試劑（試劑1)然后再加入試劑2或者樣品，然后會(huì)讀取空白（這個(gè)空白可能是試劑1和試劑2的空白吸光度也可能是試劑1和樣品的空白吸光度），如果是三試劑會(huì)再加入試劑3，緊接著才開始讀取反應(yīng)吸光度。這里有一點(diǎn)要注意：當(dāng)樣品加入時(shí)，儀器默認(rèn)這個(gè)時(shí)間為0，在樣品之前加入的試劑，時(shí)間設(shè)置為負(fù)數(shù)，之后加入的試劑時(shí)間設(shè)置為正數(shù)，這一點(diǎn)不同儀器設(shè)置的是不一樣的。

上圖是TP（單試劑）的設(shè)定參數(shù)，從中我們可以看出第一次加入試劑1（A）300ul，時(shí)間默認(rèn)為-180S，溫育84s（180-96）后后-96至-64s讀取空白吸光度，0s的時(shí)候加入樣品，繼續(xù)溫育，304至336s讀取反應(yīng)吸光度。

TP的檢測原理：蛋白質(zhì)是由許多氨基酸通過肽鍵相互結(jié)合而成的，肽鍵在堿性溶液中，能與銅離子作用產(chǎn)生紫紅色絡(luò)合物，在540nm有吸收峰，并與蛋白質(zhì)含量成正比。

蛋白質(zhì)+銅離子→紫紅色絡(luò)合物

上圖為TP的反應(yīng)曲線，a點(diǎn)（-180s）為試劑1（含銅離子的堿性溶液）加入時(shí)間；b-c（-96至-64s）為試劑空白讀取時(shí)間，對應(yīng)的-0.086左右為試劑空白；d點(diǎn)（0s）為樣品加入時(shí)間，此時(shí)反應(yīng)開始，從圖中我們可以看出吸光度快速上升，說明該波長（540nm）下檢測的吸光物質(zhì)（紫紅色絡(luò)合物）快速大量生成，并且很快達(dá)到平衡；e-f（304-336s）為反應(yīng)讀取時(shí)間，對于終點(diǎn)法來說，認(rèn)定這個(gè)時(shí)間反應(yīng)已經(jīng)到達(dá)平衡，這是的吸光度(0.110左右)就是反應(yīng)的最終吸光度，講反應(yīng)吸光度減去空白吸光度就是吸光度的變化值，這個(gè)變化值與樣品中TP的含量成正比。

上圖是ALT的設(shè)定參數(shù)，從中我們可以看出第一次加入試劑1（A）200ul，時(shí)間默認(rèn)為-180S，同時(shí)（-180s）加入試劑2（B）40ul，溫育76s（180-104）后-104至-36s讀取空白吸光度，0s的時(shí)候加入樣品，繼續(xù)溫育，80至200s讀取反應(yīng)吸光度。

ALT的檢測原理：ALT催化L-丙氨酸的氨基轉(zhuǎn)移，生成丙氨酸。丙氨酸與NADH在LDH的催化下反應(yīng)生成乳酸和NAD+, NADH在340nm處有特異吸收峰，其被氧化的速度與血清中ALT的活性成正比，在340nm處測定NADH下降速率，即可測出ALT活性。

上圖為ALT的反應(yīng)曲線，a點(diǎn)（-180s）為試劑1（L-丙氨酸，LDH）加入時(shí)間，同時(shí)（-180s）還加入了試劑2（NADH）；b-c（-104至-36s）為試劑空白（試劑1+試劑2）讀取時(shí)間，對應(yīng)的0.800左右為試劑空白；d點(diǎn)（0s）為樣品加入時(shí)間，此時(shí)反應(yīng)開始，從圖中我們可以看出吸光度慢慢下降，說明該波長（340nm）下檢測的吸光物質(zhì)（NADH）慢慢減少，并且一直都沒有到達(dá)反應(yīng)平衡（平衡時(shí)反應(yīng)曲線會(huì)變成水平線）；e-f（80-200s）為反應(yīng)讀取時(shí)間，對于速率法來說，認(rèn)定這個(gè)時(shí)間反應(yīng)還未到達(dá)平衡，這時(shí)候曲線下降的速度即曲線的斜率樣品中ALT的活性成正比。