前列腺素E2構成肌肉干細胞正常功能、再生及增強的必要條件

長生果與無花果 2018-07-20

展開全文

Prostaglandin E2 isessential for efficacious skeletal muscle stem-cell function, augmenting regenerationand strength

【文獻來源】Atv H, Palla A R, Blake M R, et al. Prostaglandin E2 is essential for efficacious skeletal muscle stem-cell function, augmenting regeneration and strength. Proc Natl Acad Sci U S A, 2017, 114(26):201705420.

“肌肉損傷本是多種細胞參與的炎性過程，而骨骼肌細胞是一類靜止的肌肉特異性干細胞（MuSCs）參與組織再生。本次研究作者發現作為炎性因子的前列腺素E2（PGE2）通過與其受體EP4結合參與肌肉干細胞的延伸….”

—

肌肉損傷時PGE2的劇增加速MuSCs增殖

由于細胞損傷和再生過程是一個復雜的炎癥反應過程，因此作者推測可能存在著某個炎性因子在肌肉再生中扮演重要作用。首先作者檢測了從未受傷的肌肉組織中分離MuSCs（Fresh MuSCs），分離培養2d的（Cultured MuSCs）以及原代肌成纖維細胞（Myoblasts GM）和分化的肌纖維細胞（Myoblasts DM）中PGE2的受體Ptger4 (EP4)表達水平（圖1A，肌肉干細胞MuSCs可發育分化為成肌細胞(myoblasts)，后者可互相融合成為多核的肌纖維，形成骨骼肌最基本的結構。這個結果告訴了我們細胞分化程度越高對PGE2受體表達水平越低，也就是說對PGE2敏感性越差，這就奠定了PGE2可能在肌肉是損傷時候其目的作用細胞主要是MuSCs，因此本文也就圍繞MuSCs展開研究，隨后作者通過在虎蛇毒素（notexin）或低溫損傷肌肉后3d檢測到PGE2及其合成酶Ptges和 Ptges2的高表達（1B,C,D）。由于PGE2產生可能不僅僅只在MuSCs，作者檢測還有肌成纖維細胞也表達,使用非甾體抗炎藥NSAIDS（背景知識：（COX-2為同工酶，是誘生型酶。COX-2在正常組織細胞內的活性極低，當細胞受到炎癥等刺激時，其在炎癥細胞中的表達水平可升高至正常水平的10-80倍，引起炎癥部位PEG2、PGI2和PGE1含量的增加，導致炎癥反應和組織損傷。非甾體抗炎藥NSAIDS是通過抑制COX，阻斷花生四烯酸轉化為PGs，從而發揮其抗炎、止痛和解熱作用）吲哚美辛抑制PGE2表達（1E，因為雖然在肌肉損傷時候可能成纖維細胞也參與但是基于前面的結果，作者排除掉了成纖維而選擇MuSCs來研究，此處作為一個補充說明）。同時作者還發現PGE2表達峰值在短時間內是和肌肉損傷后MuSCs的延伸和促炎因子表達密切相關。（這些實驗只為證實：肌肉損傷=局部炎癥反應=PGE2高表達）

為了探討PGE2是否對MuSCs有直接促進增殖作用，作者發現，PGE2能夠顯著促進增殖（1F），為了進一步證實，隨后血清中去除PGE2后增殖效果消失，加上后又回復這種增殖效果（這就是本文反復提到的gain- or loss-of-functionexperiments，體現實驗嚴謹的地方）。隨后，為了進一步支撐這個結果，作者進行了下面一系列實驗：1采用延時顯微成像系統記錄了單個MuSCs在PGE2干預下的行蹤（1G-1K），發現PGE2使得細胞更加活躍了；2 Clonalassays（具體沒去查是個什么實驗，但是可以看出這也是一個測增殖的實驗）顯示PGE2加速MuscS的更替（也就是說細胞生長更快的意思），而這一切是通過加快MuSCs有絲分裂，從而促進延伸（1G,1H）；3.PGE2處理組細胞的尺寸更大（1K）。

這么多實驗就是證實一件事：PGE2促進增殖，（注意：本文增殖實驗有哪些實驗方法！）

—

PGE2促進MuSCs細胞再生

這部分是體內實驗，用來支撐結果1的結論的。作者從轉基因小鼠上分離自帶熒光片段和熒光素梅的MuSCs（GFP/luc），隨后將這些細胞交聯PGE2注射到損傷的脛骨前肌中（TA）；結果顯示當然有效（感興趣的可以了解下BLI ASSAY具體是個什么評估實驗）：具體：把分離的帶熒光標記的MuSCs注射后觀察是否在損傷處穩定表達，隨后進行2次損傷（黑蛇毒素和冷凍損傷）檢測MuSCs體內熒光表達，他的多少可以反映MuSCs在體內的數量，也就是說PGE2處理后的在體內熒光值多些，意味著PGE2處理的MuSCs在損傷時候增殖更快，更有利于再生（2A）。同樣，直接注射PGE2也顯著促進損傷區域MuSCs的增殖（2B）（背景知識：作者選擇PAX7來標記增殖的MuSCs，通過檢測PAX7來定量）

背景知識： Pax7 是在衛星細胞中表達的標志性基因，肌肉衛星細胞，又稱為肌肉干細胞，決定著骨骼肌的生長和再生。Pax7 和 MRFs （生肌決定因子）家族成員相互作用共同參與肌肉的生成和分化過程。其中，肌纖維形成過程主要包括活化、分化和融合三個階段。

C,D結果說明PGE2使得再生增強，E:PGE2使得細胞尺寸變大，F,G是作者為了排除內源性的MuSCs干擾，采用PAX7基因敲除鼠，在TAM（他莫昔芬）注射后，即條件性敲除PAX7也就是把內源性的MUSCs排除，再外源注射MUSCS，再BLIassay評估（G），發現，熒光值還是增強。上述結果進一步證實，PGE2確實可以通過促進MUSCS增強肌肉組織再生能力。

—

PEG2是通過EP4受體介導的信號來促進MUSCS增殖和融合

結果1和結果2是給足了證據證實PGE2可以促進再生，那么接下來就是討論背后機制了。首先肯定是檢測受體了，也就是作者發現作用后4個受體中EP4表達最高（3A），并且下游cAMP水平也升高（3B）。隨后便是圍繞EP4進行一個gain- or loss-of-functionexperiments，即，在PGE2的干預下抑制或者恢復EP4受體，檢測對MuSCs增殖影響(3C),接下來在EP4基因敲除鼠上進一步驗證MuSCs在損傷處的增殖（3D）和移植（3E）。

這一部分實驗好理解，就是體內體外證實PGE2是通過EP4受體來發揮作用。實驗很嚴謹，體內外結合，無可挑剔。作者引入cAMP，已知的EP4下游分子，間接也證實了PGE2-EP4-cAMP。后續可以通過觀察cAMP水平也可以反映EP4或PGE2的處理變化（慢慢意會）。

—

轉錄因子NURR1是PGE2/EP4信號通路下游mediator

作者找出了PGE2-EP4了，畢竟這個點還太淺，與本身的受體結合這個誰都可以想得到，做的并不深入，隨后找出下游的作用分子，作者通過RNA-seq技術進行篩選（4A）。結合已知報道的與PGE2-cAMP有關的，最終篩選出NURR1分子。接下來就是證實NURR1這個分子在PGE2處理的變化了（常規思路：先qPCR檢測確認PGE2處理后NURR1變化，隨后，干擾NURR1后在PGE2干預下細胞的增殖變化等等）。4B: （體內）虎蛇毒素損傷后肌肉組織中NURR1的變化（和前面PGE2的一致），4C: （體外）MuSCs在PGE2處理下NURR1在mRNA（4C）和蛋白水平（4D）均升高。干擾NURR1后，PGE2的促增殖效果消失（E）.為了進一步確認NURR1是EP4下游分子，隨后條件性敲除EP4小鼠上得到驗證。（F,G）

結論： These data implicate thetranscription factor NURR1 as a mediator of PGE2/EP4 signaling that triggersMuSC expansion.

—

PGE2信號的確實影響組織再生

已經驗證了EP4是PGE2中間環節，那么敲除EP4也就是可以阻斷PGE2信號傳遞了。A:敲除效率驗證；B：敲除后eMyHC（eMyHC：未成熟纖維的標記，大量存在即可以理解為“夭折”）表達升高。D，E均是EP4敲除后，eMyHC的表達均上升（提示：Pax7 CreERT2: EP4 f/f 這個基因敲出鼠，意思是定點敲出MuSCs上EP4）。

然后接下來就是證實通過敲出EP4來阻斷PGE2信號檢測對肌肉強度的影響了，這里作者選了2個指標G和H：抽搐和破傷風力量（此處翻譯可能不當：原文：twitch and tetanusforce）；后續實驗也就是圍繞這倆指標展開，同前面一樣，只是不再使用基因敲除鼠了，采用的是NSAID非甾體抗炎藥來抑制PGE2的合成。