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隨著測序價格下降，腫瘤基因組學研究的深入，單從傳統的取樣模式進行隊列研究，已經很難在原來的基礎上有更具創新的發現。以往的腫瘤基因組學研究已經較為全面地揭示了腫瘤發生發展過程中的突變如SNV、CNV、SV等，和其所影響的生物學通路，但在解釋腫瘤發生機制和腫瘤治療方面并沒有提供太大幫助，原因在于腫瘤存在異質性，克隆進化分析是研究腫瘤異質性的一個強有力手段，通過研究區分腫瘤進化過程里中的早期突變（主克隆 ）和晚期突變（亞克隆），構建該腫瘤的突變進化歷史，能夠很好地解釋腫瘤的發生轉移機制，從而給該腫瘤靶向治療藥物的開發提供基礎。
文章題目：Tracking the evolution of non–small-cell lung cancer
研究人員：英國弗朗西斯·克里克研究所Charles Swanton教授領導的研究團隊 發表時間：2017.04 期刊名稱：NEJM 影響因子：72.406
隨著測序價格下降，腫瘤基因組學研究的深入，單從傳統的取樣模式進行隊列研究，已經很難在原來的基礎上有更具創新的發現。以往的腫瘤基因組學研究已經較為全面地揭示了腫瘤發生發展過程中的突變如SNV、CNV、SV等，和其所影響的生物學通路，但在解釋腫瘤發生機制和腫瘤治療方面并沒有提供太大幫助，原因在于腫瘤存在異質性，克隆進化分析是研究腫瘤異質性的一個強有力手段，通過研究區分腫瘤進化過程里中的早期突變（主克隆 ）和晚期突變（亞克?。?，構建該腫瘤的突變進化歷史，能夠很好地解釋腫瘤的發生轉移機制，從而給該腫瘤靶向治療藥物的開發提供基礎。
研究腫瘤異質性的克隆進化分析主要有兩個緯度：一個是時間緯度，即腫瘤發生不同時期或是用藥前后取樣；另一個是空間緯度即腫瘤組織的不同區域取樣。目前在兩個緯度方面，白血病、腎癌、肺癌、膠質瘤等腫瘤已經進行了相關研究，成功揭示了腫瘤進化過程中的關鍵突變，本文暫以發表在NEJM的“Tracking the evolution of non–small-cell lung cancer”多區域測序為例對該分析進行詳細探討。
樣本選擇：每個病人取3-4塊不同樣本，每塊樣本大概3x3x3mm，每塊之間間隔0.3cm~1cm。本研究從100個非小細胞肺癌病人中挑選了327塊腫瘤樣本和100個正常樣本進行平均深度為426x的外顯子測序（圖1）。 
圖1 取樣位置 分析方法： 利用SNP頻率檢測避免病人之間樣本交換 來自于同一個病人的所有腫瘤區域樣本和對應正常的樣本在除去體細胞突變之后，應該具有高度的snp相似性，通過選取之前Pengelly et al鑒定的24個SNP位點的等位基因變異頻率來避免樣本的錯誤交換。
突變檢測 Bwa mem 比對，Picard 處理原始比對數據。 Samtools mpileup去除測序質量或比對質量小于20的reads VarScan2 檢測突變 支持reads數在10條以上 突變頻率(VAF)在1%以上 腫瘤純度在50%以上的“high confidence”突變挑選進入下輪分析
同時用Mutect進行突變檢測用于驗證降低假陽性 VAF >= 2%, VarScan2“p-value < 0.01”和mutect=""> VAF >= 5%, VarScan2 “p-value <=> 測序深度>=30,支持reads>=5 正常組織突變 支持reads<5 和vaf=""><>
獨立驗證降低snp污染 計算突變在所用樣本中的群體突變頻譜 群體頻率>1%的snv去除 樣本>5%的snv若在其他病人中認定是snp，則去除所有被認定為snp的snv 去除來自于UCSC Genome Table Broser關于簡單重復，片段復制和微衛星區域的snv
Indels用以上同樣的方法進行過濾 >=10 支持reads, p-value <= 0.001,="">=50的測序深度
driver 突變識別 從COSMIC數據庫腫瘤基因譜中提取q < 0.05的基因列表，加上以往非小細胞肺癌大規模測序研究中的基因構建driver=""> 通過Sift, Polyphen, MutationTaster三種預測變異是否有害的算法，來識別driver 突變。
拷貝數變異分析 Varscan2，最低深度8，最小長度50。 LogR Ratio GC矯正。 去除低質量snp。即在至少20個樣本中，在0.1-0.32或者0.68-0.9的BAF頻率高于<0.1或>0.9 乘以0.13469的snp。 ASCAT處理Log R 和BAF，得到allele-specific copy number data和純度信息。
克隆分析 snv和cnv以上所有的突變用PyClone進行分類為主克隆或亞克隆，不能進行分析的若出現在病人所有測序區域的則為主克隆，其余為亞克隆。 對于病人所有區域均出現一個染色體臂的75%以上擴增或丟失，則識別為主克隆染色體臂變化。 根據突變所在的拷貝數來確定突變時間，若>1為早期，小于1則為晚期。所以突變將被分為五類，早期主克隆，早期亞克隆，晚期主克隆，晚期亞克隆。對于不能確定突變時間的，則為clonal untimed。 計算cnv片段上的突變拷貝數增加比例，若是大部分為1，則意味著突變發生在拷貝數變化之前，則這個片段為晚期。若是大部分很低小于1，則意味著突變發生在之后，則這個片段為早期。對于突變不足小于5的區域，則定義為clonal untimed。 計算cnv片段上的突變拷貝數減少比例，這里只考慮全基因組擴增情況。若是出現LOH片段，則為早期。沒有出現LOH，則為晚期。而不是全基因擴增情況的則為clonal untimed。 識別拷貝丟失導致的亞克隆突變。 確定各cluster group的中位數CCF，只考慮<> 使用one-sided Wilcoxon test 或one-sided Cochrane Armitage trend test，regression analysis來確定該亞克隆突變是否跟拷貝數丟失有關。 若是85%以上的group突變跟拷貝數丟失有關，則這個亞克隆group就是拷貝數丟失導致的。 為避免過度估計，只考慮在病人75%以上區域出現拷貝數丟失的情況。
進化歷史樹構建 使用CITUP軟件。 > 2 區域，>2突變cluster Pigeonhole原則。一個區域的兩個突變cluster的ccf相加若是超過100%，則一定不會互為獨立分支進化，且相對較低ccf的cluster是較高的cluster進化而來。 為確保準確性。只有超過5個突變的cluster才考慮。
結果 基因組異質性。染色體高不穩定性與差預后顯著相關（圖2）。 
圖2 基因組異質性，染色體高不穩定性與差預后顯著相關 觀察到非小細胞肺癌存在廣泛的異質性，平均30%（0.5-0.93）的體細胞突變和48%（0.3-0.88）的拷貝數變化為亞克隆。表明在腫瘤發展中，基因組不穩定性導致突變和染色體水平的改變是很重要的一個因素。 觀察到若是只單獨考慮一個區域，多區域發現75%的亞克隆突變將會被識別為主克隆突變，揭示了腫瘤存在亞克隆選擇進化。 觀察到細胞腺癌和鱗癌在亞克隆的數目和比例方面并沒有顯著差異，鱗癌的異質性跟臨床特征并無顯著關聯，而在腺癌中，腫瘤TNM分級跟亞克隆突變的比例和亞克隆拷貝數比例正相關，Ki67染色也跟突變負荷正相關，同時具有吸煙歷史的腺癌病人的亞克隆突變和主克隆突變負荷均顯著高于未有吸煙歷史的人。 觀察到亞克隆突變比例跟腫瘤復發并無顯著相關，但是高亞克隆拷貝數比例與差預后顯著相關，多因素分析矯正依然顯著，而從拷貝數影響的基因組范圍來看跟預后并不相關，表明動態的染色體不穩定性相比基因組狀態，更適合做為一個臨床的預后指標（hazard ratio, 4.9; P=4.4×10?4）。
等位基因鏡像不平衡分析（圖3）。 
圖3 等位基因鏡像不平衡分析 分析多個區域的同位點亞克隆拷貝數變化，推斷62%的腫瘤病人存在染色體不穩定性介導的腫瘤平行進化模型，從而也可能導致13%的亞克隆突變，可能是腫瘤異質性的啟動點。 76%的病人存在基因組復制事件，且大部分為主克隆，表明是非小細胞肺癌的一個早期事件。同時在腺癌中觀察到基因組復制事件跟突變和拷貝數變化的亞克隆比例存在顯著相關性。
非小細胞肺癌腫瘤進化歷史（圖4）。 
圖4 非小細胞肺癌腫瘤進化歷史
揭示特定基因和特定拷貝數變化在腫瘤發生發展中的作用。 既是主克隆同時也大多發生在基因組復制之前表明該突變在腫瘤進化過程中的啟動作用。如腺癌中的EGFR/MET/BARF突變或擴增, TERT 擴增/8p 丟失/5p 擴增；鱗癌中的NOTCH1 突變, FGFR1擴增，3p/4p/5q/17p丟失等。 主克隆但是大都發生在基因組復制之后表明起到維持腫瘤穩定或者進化作用。如腺癌中KMT2C/COL5A2突變，鱗癌中PIK3CA突變。 跟染色質修飾和DNA損傷修復應答和修復相關的基因更傾向于發生在腫瘤進化過程中的后期。如NF1/NOTCH1/3p/13q/MLH1／KRAS。
基因組復制和動態染色體不穩定性跟腫瘤異質性有關，且導致了拷貝數變化的平行進化，如CDK4/FOXA1/BCL11A擴增。
以上就是整個非小細胞肺癌多區域測序的分析方法和研究結果，同時也有采用類似方法從液態活檢ctDNA層面來研究構建腫瘤進化歷史。相對于單次取樣容易低估亞克隆高估主克隆存在偏向性，單細胞取樣的昂貴價格和較高的測序錯誤率，多區域測序在目前來說是一個研究腫瘤克隆結構和構建進化歷史的經濟可行方法。能夠在一定程度上揭示腫瘤進化過程中突變分屬的不同角色，或起始引發或維持或促進腫瘤惡化復發轉移，給腫瘤的藥物治療提供一個精準的開發方向。
參考文獻： [1]. Jamal-Hanjani M, Wilson G A, McGranahan N, et al. Tracking the evolution of non–small-cell lung cancer[J]. New England Journal of Medicine, 2017, 376(22): 2109-2121.
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