【海普周報(bào)】一文讀懂熱議詞匯——“免疫組庫”

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【海普周報(bào)】液體活檢：關(guān)于ctDNA、cfDNA的那些事兒（下）

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近年來，免疫治療已經(jīng)成為腫瘤精準(zhǔn)治療中較為熱門和有前景的治療手段。在去年10月中旬，紐約癌癥研究所（CRI，Cancer Research Institute）在Nature Reviews Drug Discovery上公布了《Trends?in the?global?immuno-oncology?landscape》調(diào)查的報(bào)告，報(bào)告表示：在過去1年內(nèi)，全球免疫療法管線激增67%；癌癥免疫療法的靶點(diǎn)增長了約50%；有臨床開發(fā)項(xiàng)目的企業(yè)與機(jī)構(gòu)數(shù)增加42%。

雖然免疫檢查點(diǎn)抑制劑 （如 PD-1/PD-L1抗體或 CTLA-4抗體）和工程免疫細(xì)胞[如嵌合抗原受體細(xì)胞（CAT-T）或新生抗原特異性T細(xì)胞受體（TCR-T）] 在臨床應(yīng)用中取得了巨大的進(jìn)展，但既往研究也表明，腫瘤免疫治療適用人群有限，免疫檢查點(diǎn)抑制劑的單藥治療有效率整體偏低，用不同的Biomarker去區(qū)分的免疫治療受益人群有可能也只是其中的一個(gè)子集，對免疫治療表現(xiàn)出有效的免疫反應(yīng)，癌癥的診斷、監(jiān)測和治療選擇目前仍然有限。

因此，對癌癥免疫學(xué)機(jī)制的深刻理解是很必要的，臨床上也迫切需要更有效的腫瘤診斷、監(jiān)測和治療方法。而對癌癥免疫和免疫譜（immune profiles）要素的鑒定和研究是預(yù)測和優(yōu)化腫瘤治療反應(yīng)的路徑之一。

自適應(yīng)免疫，在有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，它需要人體的多種免疫細(xì)胞，其中以T細(xì)胞和B細(xì)胞為主，它們分別通過其細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（T-cell receptors，TCRs）和B細(xì)胞受體（B-cell receptors，BCRs）來識別各種抗原而發(fā)揮免疫作用。因此開發(fā)分析和評估TCRs/BCRs的方法有助于開發(fā)有效的免疫治療診斷和監(jiān)測工具，即我們常聽到的對“免疫組庫”的研究。

免疫組庫（Immune Repertoire，IR）是指在任何指定時(shí)間，某個(gè)個(gè)體的循環(huán)系統(tǒng)中所有功能多樣性B細(xì)胞和T細(xì)胞的總和。

如何去理解“免疫組庫”呢？我們先把目光放到更大的整體——免疫系統(tǒng)。免疫系統(tǒng)是以團(tuán)隊(duì)的形式工作的，包括許多不同成員，而這些成員又可以被分為兩大類：固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在個(gè)體抵御外界抗原侵襲時(shí)起到重要作用。

人體有3道防線以抵御外界抗原侵襲。

人體的第一道防線是物理屏障（我們通常認(rèn)為皮膚是我們最主要的第一道防線）。病毒、細(xì)菌、寄生蟲和真菌等抗原等若想對機(jī)體造成實(shí)質(zhì)性傷害時(shí)需要先突破這道物理屏障；

所有突破了皮膚、黏膜這些物理屏障的抗原會迎來第二道防線——固有免疫系統(tǒng)。固有免疫系統(tǒng)是人體中已經(jīng)進(jìn)化了數(shù)百萬年（相當(dāng)于先天）的免疫系統(tǒng)，通過識別對機(jī)體有害的病原體、細(xì)菌等，同時(shí)對各類抗原起到快速而強(qiáng)力的清除作用，從而保護(hù)人體不受侵襲。巨噬細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)中非常重要的成員，大約99%的動(dòng)物在自然屏障和固有免疫系統(tǒng)的保護(hù)下都可以健康存活。

然而，對于我們這樣的脊椎動(dòng)物，大自然給予了我們第三道防線：適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。這是一種可以適應(yīng)攻擊機(jī)體的幾乎所有抗原的防御系統(tǒng)，B細(xì)胞和T細(xì)胞是其重要的成員。個(gè)體所有細(xì)胞起源于干細(xì)胞，因此來自于固有免疫系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞和來自于適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的T細(xì)胞和B細(xì)胞具有相同的起源（見圖1）。

▲圖1 干細(xì)胞分化的若干去路

固有免疫系統(tǒng)會記憶百萬年間攻擊過人類的抗原，而B細(xì)胞和T細(xì)胞則會記憶人類出生后所接觸過的抗原，并同時(shí)產(chǎn)生記憶B細(xì)胞和記憶T細(xì)胞，記憶B細(xì)胞和記憶T細(xì)胞使人體在受到相同抗原的第二次刺激后可以更迅速的發(fā)出反應(yīng)，這便形成了免疫記憶。

T細(xì)胞在外觀上與B細(xì)胞非常相似，在一個(gè)普通的顯微鏡下可能無法將它們區(qū)分開來。但B細(xì)胞與T細(xì)胞也有區(qū)別：

• B細(xì)胞在骨髓中成熟，而T細(xì)胞在胸腺中成熟；

• B細(xì)胞制造的抗體可以識別所有有機(jī)分子，但T細(xì)胞專門識別蛋白抗原；

• B細(xì)胞可以以抗體的形式分泌受體，但是T細(xì)胞受體保持在細(xì)胞表面上；

• 最重要的區(qū)別是，B細(xì)胞能夠自己識別抗原，而T細(xì)胞不能直接識別抗原表位，只有在被抗原呈遞細(xì)胞（APC）“正確呈遞”的情況下才會識別出抗原，即只能特異性識別APC或靶細(xì)胞表面提成的抗原肽-MHC分子復(fù)合物（pMHC）。
  

T細(xì)胞與B細(xì)胞表面上都存在抗體分子，分別稱為T細(xì)胞受體（TCRs）和B細(xì)胞受體（BCRs）。機(jī)體的每一種抗體都與一種特殊的抗原結(jié)合在一起，因此，為了使抗體能夠與許多不同的抗原結(jié)合，需要分泌許多不同的抗體分子。

那么，如果我們想要抗體可以保護(hù)機(jī)體不受任何入侵者危害，我們需要多少種不同的抗體呢？

根據(jù)免疫學(xué)家粗略估計(jì)，大概需要1億種抗體才可以滿足人體需要。拿BCRs來說，由于抗體的每個(gè)抗原都是由一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈組成的，所以我們可以將大約10000個(gè)不同的重鏈和10000個(gè)不同的輕鏈組合在一起，從而得到我們需要的1億個(gè)不同的抗體。然而，人類細(xì)胞中只有約25000個(gè)基因，如果每個(gè)重鏈或輕鏈蛋白都是由不同的基因編碼的，那么則需要將B細(xì)胞的大部分基因信息用來制造抗體。這就是問題所在。要了解這個(gè)問題，我們先來了解BCR和TCR的結(jié)構(gòu)以及它們在B細(xì)胞和T細(xì)胞上的位置。

▲圖2 BCR的結(jié)構(gòu)以其在B細(xì)胞上的位置

▲圖3 TCR的結(jié)構(gòu)以其在T細(xì)胞上的位置

BCR是表達(dá)于B細(xì)胞表面的免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig），B細(xì)胞通過BCR識別抗原，接受抗原刺激，啟動(dòng)體液免疫應(yīng)答。

BCR的重鏈（Heavy Chain, IgH）由編碼可變區(qū)（Virable Domain, V區(qū)）的V基因片段（variable gene segment）、D基因片段（diversity gene segment）和J基因片段（joining gene segment）以及編碼恒定區(qū)的（Constant Domain, C區(qū)）C基因片段組成。BCR的輕鏈（Light Chain，IgL）V區(qū)只有V基因片段和J基因片段。

TCR每條肽鏈的細(xì)胞膜外區(qū)各含1個(gè)V區(qū)和1個(gè)C區(qū)，V區(qū)中含有3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR1、CDR2、CDR3），是TCR識別pMHC的功能區(qū)。TCR跨膜區(qū)帶有正電，可與CD3形成鹽橋，形成TCR-CD3復(fù)合物，TCR識別抗原所產(chǎn)生的活化信號由CD3轉(zhuǎn)導(dǎo)至T細(xì)胞內(nèi)。CD3具有5種肽鏈，即γ、δ、ε、ζ 和 η 鏈，均為跨膜蛋白。

免疫組庫的克隆型通過在免疫系統(tǒng)的免疫球蛋白和T細(xì)胞受體產(chǎn)生的早期階段可變的（V）、多樣性（D）和連接（J）基因片段經(jīng)由體細(xì)胞重組的重排來確定。

受體的重排V（D）J部分（即V區(qū)）非常重要，因?yàn)樗?fù)責(zé)表位識別，當(dāng)V（D）J被翻譯成氨基酸序列時(shí)， V-區(qū)域可以被細(xì)分成由前導(dǎo)系列、框架（FR）1、互補(bǔ)性決定區(qū)1（CDR1）、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4和C-結(jié)構(gòu)域組成的幾個(gè)部分。其中CDR3特別重要，因?yàn)榧韧芯勘砻髟搮^(qū)域與抗原特異性有關(guān)，故研究CDR3序列的特異性與多樣性對于識別TCR/BCR具有重要意義。

因此有些“免疫組庫”意指實(shí)際在一個(gè)或多個(gè)個(gè)體的淋巴細(xì)胞中檢測到的一組不同的CDR3序列。

1977年的諾貝爾獎(jiǎng)得主利根川解開了機(jī)體抗體多樣性這個(gè)謎團(tuán)：機(jī)體通過模型化設(shè)計(jì)（modular design）達(dá)到抗體的多樣性（見圖4）。

▲圖4 BCR重鏈（IgH）基因重排和表達(dá)示意圖

（重鏈胚系基因經(jīng)過重排先形成D-J連接，然后發(fā)生V-DJ連接，編碼功能性V區(qū)基因）

即在每一個(gè)B細(xì)胞中，含有重鏈基因序列的染色體上有四種不同的DNA基因片段分別稱為V、D、J、C。在人類中，大約有40個(gè)不同的V段，大約25個(gè)不同的D段，6個(gè)不同的J段等，為了合成一個(gè)成熟的重鏈基因，每一個(gè)B細(xì)胞都選擇（隨機(jī)的）一種基因片段并將它們像這樣組合在一起，含有抗體輕鏈遺傳信息的染色體也通過選擇基因片段并將它們粘在一起來組裝，多種不同的基因片段進(jìn)行混合和匹配增加了產(chǎn)生抗體的多樣性。

但這還不夠，為了使抗體的多樣化繼續(xù)增強(qiáng)，當(dāng)基因片段連接在一起時(shí)，額外的DNA堿基會被增添或刪除，這種重組多樣性和連接多樣性使得只需要少量的遺傳信息就能創(chuàng)造出超出想象的抗體多樣性。

與BCRs一樣，TCRs也是由一種混合與搭配模塊化設(shè)計(jì)策略來制造的。因此，TCRs與BCRs一樣具有多樣性。可簡單理解為：T細(xì)胞和B細(xì)胞基因座上大量的V、D、J基因片段在T細(xì)胞受體（TCR）和B細(xì)胞受體（BCR）的形成過程中會產(chǎn)生各種多樣性重組，V-D-J基因的重組賦予了每一種T、B細(xì)胞獨(dú)特的TCR、BCR，從而使得每一個(gè)TCR和BCR序列能有效的成為一個(gè)T、B細(xì)胞克隆的唯一生物標(biāo)志物。

一般來說，不同個(gè)體之間TCRs/BCRs組庫的數(shù)目由于年齡、外源性抗原和內(nèi)源性等因素的影響而相差甚遠(yuǎn)。由于腫瘤可以通過躲避人體T淋巴細(xì)胞進(jìn)而生長，增殖，轉(zhuǎn)移，因而免疫系統(tǒng)不能有效將其識別。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL細(xì)胞）的存在是人體抗擊癌癥的一個(gè)積極成果，TIL細(xì)胞的存在常被認(rèn)為是人體對腫瘤產(chǎn)生反應(yīng)的結(jié)果。研究者可通過對不同癌癥組織中的TIL免疫組庫的研究中找到線索。

Keane（2017）等通過高通量免疫組庫測序技術(shù)（HST-IR）對92例彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者腫瘤組織中TCR庫進(jìn)行測序分析，結(jié)果顯示 ：與正常淋巴結(jié)組織相比，病變淋巴結(jié)組織中TCR多樣性明顯受限，TCR的多樣性程度與腫瘤組織中免疫檢查點(diǎn)相關(guān)蛋白（如PD-L1和PD-L2等）的表達(dá)呈正相關(guān)，這可能為選擇免疫治療方案提供證據(jù)支持 ；且在患者腫瘤組織微環(huán)境中，TCR庫表現(xiàn)為高克隆低多樣性特征，這些高頻克隆型的擴(kuò)增與患者不良預(yù)后相關(guān)。

免疫組庫技術(shù)還可應(yīng)用于血液癌癥的微小殘留病變（Minimal Residual Desease，MRD）。淋巴樣受體基因的測序有可能提高臨床診斷效力和MRD監(jiān)視淋巴組織增生疾病的潛力。

免疫組庫除了在腫瘤免疫、腫瘤監(jiān)測/評估方面的應(yīng)用外，還可應(yīng)用于移植和免疫重建、自身免疫性疾病、感染類疾病、抗體的開發(fā)、用藥和疫苗的評估等方面（見圖7）。

▲圖5 免疫組庫的應(yīng)用

那么“免疫組庫”如何測定呢？

一般TCRs/BCRs的免疫組庫測序有2種策略：

（1）基于細(xì)胞DNA，利用TCR/BCR基因的重排規(guī)律，在TCR（α/β/γ/δ 鏈）和BCR（重鏈/輕鏈）的可變區(qū)基因設(shè)置上游引物，在連接區(qū)J基因和恒定區(qū)C基因設(shè)置下游引物，通過PCR擴(kuò)增出目的鏈的PCR產(chǎn)物，但該方法存在擴(kuò)增不均一的不足，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性；

（2）基于細(xì)胞RNA，采用5’RACE技術(shù)，基于引入的接頭序列進(jìn)行第二次無偏好PCR擴(kuò)增，克服不均一性的問題，但RNA樣品處理較DNA樣品復(fù)雜，重復(fù)性也不如DNA樣品好。

得益于液體活檢技術(shù)和高通量技術(shù)的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，以血漿cfDNA/ctDNA為起始樣本，針對特異性免疫亞克隆擴(kuò)增的免疫組庫測序技術(shù)使得“液體活檢”更好的應(yīng)用于疾病的風(fēng)險(xiǎn)評估與預(yù)測。

其主要流程一般是先提取血漿的cfDNA，對BCR H鏈（重鏈）進(jìn)行全長多重PCR擴(kuò)增和TCR β鏈的CDR3區(qū)域進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，然后將2種擴(kuò)增產(chǎn)物混合后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，獲得文庫后進(jìn)行上機(jī)測序，再對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行免疫組庫精準(zhǔn)信息分析。

隨著研究技術(shù)和生信數(shù)據(jù)分析的進(jìn)步，免疫組庫的研究對于臨床上很多疾病的診斷以及預(yù)后判斷與治療都非常有前途，這是當(dāng)今前沿醫(yī)學(xué)的熱點(diǎn)和亮點(diǎn)，特別是腫瘤免疫治療，免疫組庫將會給其帶來更多的理論支持。

以上內(nèi)容根據(jù)筆者自己的理解進(jìn)行整理，若有疏漏異議，歡迎大家留言指正

主要參考文獻(xiàn)：

(1) Tang J. et al. Trends?in the?global?immuno-oncology?landscape [J] .Nat Rev Drug Discov. 2018 Oct 26.

(2) Tang J. et al. Comprehensive analysis of the clinical?immuno-oncology?landscape [J] .Ann Oncol. 2018 Jan 1;29(1):84-91. 

(3) Ye B. et al.  High-throughput sequencing of the immune repertoire in oncology: Applications for clinical diagnosis, monitoring, and immunotherapies [J] . Cancer Lett. 2018 Mar 1;416:42-56.

(4) Keane C. et al. The T-cell Receptor Repertoire Influences the Tumor Microenvironment and Is Associated with Survival in Aggressive B-cell Lymphoma [J] . Clin Cancer Res, 2017, 23(7):1820-1828.

(5) 曹雪濤.醫(yī)學(xué)免疫學(xué). [M] .第9版.北京：人民衛(wèi)生出版社.2018-07

(6) Lauren Sompayrac. How the Immune System Works [M] .FIFth EdItIon.2016.

the production mechanism and show utility in noninvasive prenatal testing. Proc Natl Acad Sci USA. May 29;115(22):E5106-E5114.（2018）

(7) Horlbeck MA, et al. Nucleosomes impede Cas9 access to DNA in vivo and in vitro. eLife 5:e12677. (2016) 

每周討論

討論：除了上期中提到的cfDNA的臨床應(yīng)用的2個(gè)難點(diǎn)，其臨床應(yīng)用還有哪些問題？

（1）標(biāo)準(zhǔn)化問題：由于實(shí)驗(yàn)平臺、技術(shù)、分析手段等缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，不同實(shí)驗(yàn)室給出的檢測結(jié)果通常存在差異，造成檢測結(jié)果互認(rèn)和比較的障礙；

（2）現(xiàn)有檢測標(biāo)志物的不足：目前cfDNA的檢測多局限于文獻(xiàn)報(bào)道，不同研究者選定的標(biāo)志物不同，缺乏對特定標(biāo)志物的大規(guī)模臨床驗(yàn)證。

討論：利用PCR方法擴(kuò)增來監(jiān)測T/B細(xì)胞的免疫組庫有怎樣的局限性？