雨生紅球藻提取物皂化前后體外抗氧化活性的研究

  趙立艷(1)， 陳貴堂（2） ，趙廣華（3），胡小松（3）

(1．南京農業大學食品科技學院，江蘇南京210095；2．中國藥科大學食品質量與安全教研室，

江蘇南京210009；3．中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083)

摘要：將雨生紅球藻藻粉經過乙醇和乙酸乙酯的混合溶劑提取后，經過皂化，得到蝦青素（超級維生素E）提取物，測定了提取物皂化前后的抑制油脂過氧化能力、清除DPPH·自由基能力和還原力，結果表明，雨生紅球藻提取物皂化前后在三種評價方法中都表現出了較強的抗氧化活性。

關鍵詞：雨生紅球藻，蝦青素，皂化，抗氧化活性

中圖分類號：TS202．3       文獻標識碼：A         文章編號：1002-0306(2008)09-0081-04

蝦青素（又名超級維生素E)不僅是色澤鮮艷的著色劑，更是功能強大的生物活性物質，很多研究表明，蝦青素具有多種生理功能，如防治與氧化相關的疾病、預防癌癥、預防與年齡相關的視黃斑退化和中樞神經疾病、增強免疫力等等。蝦青素（超級維生素E）的這些生理功能與其具有抗氧化活性密切相關，其具有很強的清除單線態氧、清除自由基和防止脂質過氧化的能力。蝦青素作為一種脂溶性抗氧化劑，類似于維生素E，在生物膜和富含脂質的組織中表現出優良的抗氧化性能，而且用小鼠肝線粒體和紅細胞進行的體外抗氧化實驗發現，蝦青素的抗氧化效果優于維生素E。飲食中抗氧化劑長期以來倍受國內外學者關注，這是因為：食物中抗氧化劑能夠保護食物免受氧化損傷而變質；在人體消化道內具有抗氧化作用，防止消化道發生氧化損傷；吸收后可在機體其他組織器官內發揮作用；來源于食物的某些具有抗氧化作用的提取物可以作為治療藥品。抗氧化劑在食品和生物體系中的抗氧化活性受很多因素的影響，其中主要包括：抗氧化劑在水相和油相間的分配效應、氧化條件和環境、被氧化底物的物理狀態等。本文選用了三種不同的抗氧化評價方法，測定了皂化前后雨生紅球藻中提取物的抗氧化活性，除了更加明確蝦青素的抗氧化機理外，還比較了提取物皂化前后的抗氧化效果。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

雨生紅球藻藻粉  荊州市天然蝦青素有限公司；亞油酸  美國Fluke公司；2，2-二苯代苦味肼(DPPH ·)  美國Sigma公司；乙醇、乙酸乙酯、甲醇、正己烷、丙酮、二丁基羥基甲苯(BHT)、氫氧化鉀、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫氰酸銨、氯化亞鐵、三氯化鐵、硫代巴比妥酸、鹽酸、三氯乙酸  均為國產分析純。

TDL-5-A 離心機  上海安亭科學儀器有限公司； AY120 型電子天平  日本島津有限公司； HZQ-C 空氣浴振蕩器   哈爾濱市東明醫療儀器廠；電熱恒溫水浴鍋   北京長安科學儀器廠； UV-190 紫外可見分光光度計   北京譜析通用儀器公司；SHB-Ⅲ 循環水式多用真空泵   鄭州市上街華科儀器廠；R-501 旋轉蒸發器   上海中順生物科技有限公司。

1．2 實驗方法

1．2．1 樣品制備

1．2．1．1 雨生紅球藻粗色素油提取物(E)的制備

稱取200mg凍干的雨生紅球藻粉，加入體積比為2：l的乙醇和乙酸乙酯的混合溶劑，按以下條件提取：溫度25℃ 、提取時間6h、溶劑量l2mL，提取2次。提取物經過離心(3000r／min，l5min)后，收集上清液，用真空旋轉蒸發器將上清液濃縮，濃縮后轉移至棕色瓶內，用氮氣揮干殘留的溶劑，密封后保存于-20℃備用。

1．2．1．2 粗色素油皂化物(S)的制備

將上述粗色素油提取物按以下條件進行皂化：粗色素油濃度4．5mg／mL、堿的濃度0．05mol／L、皂化溫度30℃ ，皂化時間20min： 得到的皂化物經過大孔樹脂除堿、硅膠分離，收集到的紅色收集液用真空旋轉蒸發器進行濃縮，濃縮后轉移至棕色瓶內，用氮氣揮干殘留的溶劑，密封后保存于-20℃ 備用。

1．2．2 提取物抗油脂過氧化力的測定

1．2．2．1   硫氰酸鐵法(FTC)   

     參考Osawa和Zainol的辦法，并略加修改。取1mL亞油酸乙醇溶液(亞油酸2．5mL溶于l00mL無水乙醇中)，與2mL0．05mol／L pH7．0的磷酸鹽緩沖液混合，超聲波震蕩30min，然后取2．0mL樣品或BHT 置于25mL 試管中，使BHT(B)、E樣品和 S 樣品的終濃度為0．05、0．1、0．2mg／mL，分別記為B1、B2、B3、E1、E2、E3、S1、S2、S3，均勻混合后，于60℃震蕩(每分鐘約80次)，每隔24h取出樣品0．1 mL，依次加入9．7mL 75％(V／V)乙醇溶液、0．1mL 30％ (W／V)硫氰酸銨溶液及0．1mL 氯化亞鐵溶液(20mmol／L氯化亞鐵溶于3．5％ (V／V)的鹽酸中)，震蕩均勻后，準確反應3min，檢測500nm 下的吸光值，吸光值越低，表示樣品的抗氧化能力越強。并以2．0mL的蒸餾水取代樣品作為對照組。

1．2．2．2   硫代巴比妥酸反應物法(TBARS)    

    在上述FTC方法中，待對照吸光值達到最大后，隔ld取樣，用于本方法的測定，具體操作如下：取樣品1mL，加入2ml 20％ (W／V)三氯乙酸(TCA)溶液和2mL 0．67％ (W／V)硫代巴比妥酸(TBA)溶液，沸水浴15min，流水冷卻后，3000r／min離心20min，以蒸餾水代替樣品作為空白管調零，取上清液在532nm 處測定吸光值，按下式計算過氧化抑制率：

過氧化抑制率(％ )=(1 - 樣品管吸光度／對照管吸光度) × 1O0％

1．2．3   清除DPPH ·能力的測定    

    用乙醇將樣品稀釋，使樣品終濃度分別為0．05、0．1、0．2、0．25、0．3mg／mL，取不同濃度的樣品溶液3mL，加入2mL 0．1mmol／L 的DPPH ·乙醇溶液，充分混勻后，于黑暗處室溫放置20min，然后測定517nm 下的吸光值，以 BHT 為參照，樣品對DPPH ·的清除率按下式計算：清除率 = [1- (A₁ - A₂)／A₀] × 100％

式中A₀ ：DPPH ·乙醇溶液的吸光值；A₁：DPPH ·乙醇溶液加入樣品溶液反應20min后的吸光值；A，：樣品溶液的吸光值。

1．2．4   還原能力的測定    

    取1．5mL濃度分別為0．25、0．5、0．75、1．0、1．25mg／mL的樣品或 BHT 甲醇溶液，加入1．5mL pH6．6的磷酸鹽緩沖溶液(0．2mol／L)和1．5mL 1％ 的鐵氰化鉀溶液，混勻，在50℃保溫20min后迅速冷卻，加入1．5mL 10％ 的三氯乙酸，混合后以3000r／min離心10min。取上清液2．5mL，加2．5mL蒸餾水和0．5mL 0．1％ 的三氯化鐵，然后在700nm 處比色，以水為空白，吸光值越大，則樣品的還原能力越強。

 2 結果與討論

2．1 抗油脂氧化能力

脂類包括的范圍很廣，是構成生物膜的主要成分，脂類中的不飽和脂肪酸(LH)會發生過氧化，脂類過氧化過程中會產生L·、LO ·、LOO ·等自由基以及LOOH，這些產物會損傷生物細胞。因此，抑制脂類過氧化具有重要的生物學意義。

硫氰酸鐵鹽(FTC)比色法是基于在酸性條件下，脂質氧化形成的過氧化物可將Fe²⁺氧化成Fe³⁺，然后Fe³⁺與硫氰酸根離子可形成在480～515nm 內有最大吸收的紅色絡合物。通常用500nm 處吸光值的高低表示物質抗脂質過氧化的能力，吸光值越小，表明物質的抗脂質過氧化能力越強。硫代巴比妥酸反應物(TBARS)值法是評價油脂的氧化程度的常用方法。油脂或亞油酸氧化后的終產物主要是丙二醛，這些過氧化產物與硫代巴比妥酸作用生成有色化合物，該有色化合物在530nm 左右有吸收。本實驗測定的抗油脂氧化能力的結果如圖1和圖2所示。

由圖中可以看出，BHT和皂化前后的樣品都顯著抑制了亞油酸的氧化，而且分析純的 BHT 的效果要比我們所用的粗提物效果好的多，比較B、E、S樣品的抗亞油酸氧化能力，我們可以看出，在相同濃度下，三種樣品的抗亞油酸氧化能力大小依次為：B>E>S。皂化前的提取物(E)比皂化后的提取物(S)抗油酸氧化能力強，這可能與它們的疏水性有關系 。

另外，三種樣品在本實驗采用的兩種測定抗亞油酸氧化的方法中都呈現出了劑量效應關系，也就是說，隨著 BHT 和雨生紅球藻提取物濃度的增加，它們的抗亞油酸氧化能力也是增強的。皂化前以蝦青素酯為主的提取物以及皂化后以游離蝦青素為主的提取物在濃度為0．05mg／mL時過氧化抑制率就達到了60％ 以上，當濃度為0．2mg／mL時，過氧化抑制率則分別達到了84．07％和81．54％ 。

2．2 清除DPPH·自由基能力

DPPH ·是一種早期合成的有機自由基，常用來評估抗氧化物的供氫能力，它在有機溶劑中非常穩定，呈紫色，而且在517nm 處有一個特征吸收峰，當遇到自由基清除劑時，DPPH ·的孤對電子被配對而使其退色，也就是在最大吸收波長處的吸光值變小。因此，可通過測定吸光值的變化，來評價樣品對DPPH ·自由基的清除效果。BHT以及皂化前后的雨生紅球藻提取物對DPPH ·的清除效果如圖3所示。

    由圖3可以看出，在相同濃度時，三種樣品的清除DPPH · 自由基的能力依次為：B >E>S。BHT 濃度為0．05mg／mL時清除率就達到了52．59％ ，隨著濃度的增加，BHT 對 DPPH ·的清除率也增加；但在本實驗的條件下，當濃度增加到0．2mg／mL后，清除率達到了90％以上，而濃度再繼續增加，清除率基本保持不變。皂化前后的提取物相比較，在相同濃度時 E 樣品要比 S 樣品清除DPPH ·能力強，這可能是由于蝦青素酯更容易與 DPPH ·的孤對電子配對。在實驗所選樣品濃度范圍內，E 和 S 對 DPPH ·自由基的清除能力都是隨著樣品濃度的增加而增強的，與 BHT 相比，在濃度為0．05mg／mL時，E 和 S 的清除能力很低，只有5％ 左右；當濃度為0．2mg／mL時，E 和 S 對 DPPH ·自由基清除率分別為39．25％和16．94％ ；當濃度為0．3mg／mL時，清除率分別增加到77．42％和26．15％ 。

2．3 還原力

還原力的測定是檢驗樣品是否是良好的電子供體的方法，還原力強的樣品應該是良好的電子供應者，它供應的電子不僅能使Fe³⁺ 還原為Fe²⁺ ，也可以與自由基反應。還原力的測定是用來評價抗氧化劑活性的常用方法。BHT 以及 E、S 樣品的還原力測定結果如圖4所示。

由結果可以看出，在本實驗使用的濃度范圍內，BHT、E、S 的還原力都是隨著濃度的增加而增強的，但是 BHT 濃度增加到1．0mg／mL后，還原力的增加就很慢了。E 和 S 相比，在相同濃度下 S 的還原能力比 E 稍強，但相差不多( 3．2％ - 8．9％ )。

 3 結論

3．1 雨生紅球藻提取物的抗亞油酸氧化能力

通過 FTC 法和 TBARS 法測定，雨生紅球藻的蝦青素提取物在很低濃度時就起到了良好的抗亞油酸氧化作用，而且這種作用隨著濃度的增加而增強，當濃度為0．2mg／mL時，兩種樣品的過氧化抑制率分別達到了84．07％ 和81．54％ 。E 和 S 比較，在相同濃度時 E 抗亞油酸氧化能力比 S 強。

3．2 雨生紅球藻提取物的清除DPPH·自由基能力

實驗中所用提取物對 DPPH ·的清除率與同濃度的 BHT 相比要低的多，E和 S 樣品對 DPPH ·的清除率和濃度成劑量關系，濃度小于0．3mg／mL時，對DPPH ·的清除率不高；當濃度為0．3mg／mL時，清除率分別增加到77．42％ 和26．15％ 。同濃度的 E 和 S 相比，E 對 DPPH ·的清除能力比 S 強。

3．3 雨生紅球藻提取物的還原力

E 和 S 的還原力均隨著濃度的增加而增強，E 和 S 相比，在相同濃度下 S的還原能力比 E 強，但相差不多( 3．2％ - 8．9％ )。