新一代溶栓藥物納豆激酶

現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志

ModernJournalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine2007Jul,16(19)

新一代溶栓藥物納豆激酶

鄧立新

(海南省人民醫(yī)院,海南海口570102)

[關(guān)鍵詞]納豆激酶;溶栓藥物;血管栓塞

[中圖分類號(hào)]R973[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008—8849{2007}19—2775—02

血栓栓塞性疾病是引起死亡的主要原因之一,是現(xiàn)今僅 次于癌癥的第二大病癥.目前,溶解血栓是治療這一類疾病 的重要手段,當(dāng)今用于臨床治療的藥物包括鏈激酶(streptki— nase,SK),尿激酶(Umkinase,UK),組織型纖溶酶原激活劑(t— PA),單鏈尿激酶型血纖溶酶原活劑(ScUPA),化學(xué)修飾的血 纖溶酶一鏈激酶激活劑復(fù)合物(APSAC)等.這些藥物均為 激活血液中的血纖溶酶原,從而降解纖維蛋白而間接地起作 用.臨床應(yīng)用方法是注射或滴注,有可能引起患者全身性內(nèi) 出血,而且在血液中的半衰期很短(3,20min),因此在使用 這些藥物時(shí)必須長(zhǎng)時(shí)間的滴注用藥,很不方便,且來(lái)源緊缺, 造價(jià)高.因此,開發(fā)新型溶血栓藥物成為當(dāng)前重要研究課題 之一.納豆激酶(Nattokinase,NK)是一種能達(dá)到'經(jīng)IEI纖溶 療法'目的的,從世界數(shù)百種食物中篩選出來(lái),安全性最高的 高效血栓溶解酶,有很強(qiáng)的溶血栓能力,跟傳統(tǒng)的一些溶栓劑 相比,具有安全性好,成本低,口服有效等優(yōu)點(diǎn),極有可能開發(fā) 為新一代的溶栓劑.現(xiàn)將納豆激酶的來(lái)源,理化性質(zhì),藥理作 用,生產(chǎn),與其他枯草桿菌蛋白酶的同源性比較,開發(fā)應(yīng)用現(xiàn) 狀綜述如下.

1來(lái)源

納豆激酶是由日本學(xué)者SumilJ于1987年首次發(fā)現(xiàn)的, 它是納豆發(fā)酵而產(chǎn)生的一種具有強(qiáng)烈纖溶作用的酶,該酶能 明顯縮短優(yōu)球蛋白的溶解時(shí)間.他們?cè)谘芯考{豆芽孢桿菌的 生理生化特征后,認(rèn)為其分類地位應(yīng)歸在枯草桿菌中.須見 洋行于1987年對(duì)納豆及其提取物首次作了系統(tǒng)研究,最初將 酶的提取物添加到纖維蛋白平板上,發(fā)現(xiàn)有明顯的溶栓作用, 并確定是一種具有纖溶活性的激酶…,從而使其成為一種很 有潛力的新型溶栓藥物.納豆激酶在日本已得到廣泛深入的 研究,在我國(guó)還剛剮起步.

2理化性質(zhì)

2.1分子量,分子結(jié)構(gòu)納豆激酶是一條由275個(gè)氨基酸殘 基組成的單鏈多肽,分子量27728,PI8.0,其氨基酸序列與 其他枯草桿菌蛋白酶的氨基酸序列有較高的同源性.納豆激 酶的活性部位在Asp22,His64,Ser221,與底物結(jié)合部位在 Ser125,Leu64,Gly127.對(duì)納豆激酶最敏感的底物是Ser—Ala— Ala—Pro,PNA,其次是His—Asp—Val,Leu—Lys—PNLJ. 2.2等電點(diǎn),穩(wěn)定性納豆激酶的等電點(diǎn)為8.6?0.3,在

DH6.0,12.0情況下,其比較穩(wěn)定,pH低于5.0時(shí),則很不 穩(wěn)定.4O?保溫30min,酶活無(wú)損失,溫度>5O?時(shí)活力逐 漸喪失,>6O?時(shí)則因蛋白變而迅速失活【3J.反復(fù)凍融對(duì)納 豆激酶的活性影響不大.當(dāng)納豆激酶與煮沸過(guò)的小麥或大米 提取液,肉湯及血清蛋白和胃黏液蛋白混合后,其穩(wěn)定性顯著 提高,甚至在酸性條件下仍保持有酶活性_4J.說(shuō)明納豆激酶 在胃環(huán)境中能保持一定的活性,因此可El服來(lái)達(dá)到溶栓目的. 3藥理作用

大多數(shù)溶栓藥物,如鏈激酶,尿激酶,t—PA等都是纖溶

酶原激活劑型,均需通過(guò)激活靶酶,即纖維蛋白溶酶原(Plas— minogen)轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白溶酶,再與纖維蛋白結(jié)合,發(fā)揮溶 栓作用,而其自身不能直接作用于纖維蛋白.納豆激酶則不

然,它對(duì)纖維蛋白尤其是交聯(lián)形式的纖維蛋白本身更加敏感, 可直接將其水解成小肽和氨基酸.當(dāng)把酶提取液滴加到纖維 蛋白平板上,短時(shí)間內(nèi)即可出現(xiàn)透明的溶解圈,體外溶栓效果 顯著.此外,將納豆激酶應(yīng)用于狗的血栓模型實(shí)驗(yàn)及健康人 群的體內(nèi)研究,表明其不僅可以抑制血栓的形成,還可迅速降 解纖維蛋白,增加纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)的量,明顯縮短血 漿中的優(yōu)球蛋白的溶解時(shí)間(ELT),提高優(yōu)球蛋白的纖溶活 性(EFA),并能降低PAl等纖溶酶原激活因子抑制子的活性, [J].江蘇中醫(yī)藥,2004,25(2):57

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[收稿日期】2006—12—25

現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志

ModernJournalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine2007Jul,16(19)

從而激活靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,引起tPA的繼發(fā)性增加,同時(shí)激 活尿激酶原(proUK)轉(zhuǎn)變?yōu)槟蚣っ?使內(nèi)源性纖溶酶量和 活性間接增強(qiáng),具有雙重功能.研究表明,納豆激酶的溶栓效 果遠(yuǎn)大于纖溶酶和彈性蛋白酶,活性是纖溶酶的4倍.另 外張利等Z6]通過(guò)納豆激酶纖維蛋白溶解活性實(shí)驗(yàn),納豆激酶 體內(nèi)血栓溶解實(shí)驗(yàn)對(duì)納豆激酶的溶栓作用做了較全面的研 究.體內(nèi)血栓溶解的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:納豆激酶可明顯延長(zhǎng)血 栓形成時(shí)間,顯著減少股動(dòng)脈的長(zhǎng)度及濕質(zhì)量并明顯提高血 栓的再通率,顯著減少肺內(nèi)血栓的形成,表明納豆激酶具有較 強(qiáng)的體內(nèi)溶栓作用,且同等劑量的納豆激酶和尿激酶相比,前 者的溶栓作用高于后者.顯示了納豆激酶具有強(qiáng)大的溶栓作 用,且起效快,藥效長(zhǎng).由于納豆激酶的安全性,穩(wěn)定性和良 好的溶解血栓的作用,其有可能作為口服試劑用于血栓的預(yù) 防和治療,成為一代新的溶栓藥物.

4生產(chǎn)

最初獲得的納豆激酶都是從傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的納豆中提 取,但不適用于大規(guī)模生產(chǎn).因此人們轉(zhuǎn)而探索液體發(fā)酵生 產(chǎn)的方法.日本的方法液體培養(yǎng)的最適溫度為28.5?左右, 超過(guò)32?幾乎不顯示活性;最適碳源為麥芽糖.付利等J的 研究結(jié)果顯示,發(fā)酵后4d酶活性達(dá)到最大,最適碳源為木 糖,最適氮源是大豆蛋白胨,最適溫度為37?.本實(shí)驗(yàn)室的 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與黑龍江應(yīng)用微生物所得結(jié)果基本相符,與日本的 研究有出入,可能是由于菌種不同所致.

另外還有報(bào)道,在培養(yǎng)基中添加海帶提取液,可以促進(jìn) NK的生產(chǎn).由于納豆激酶具有目前正在使用的一些溶栓

劑所無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn),因此,人們渴望能將其開發(fā)為新一代的 溶栓劑.但從目前研究情況來(lái)看,納豆激酶的產(chǎn)量還不高,難 以滿足需要,故而要將其開發(fā)為實(shí)用的新型溶栓劑,提高納豆 激酶的產(chǎn)量就變得非常關(guān)鍵.常用的提高納豆激酶產(chǎn)量的途 徑有3種:通過(guò)對(duì)野生菌種的篩選,誘變,挑選出產(chǎn)酶量高的 菌種;優(yōu)化納豆的發(fā)酵條件;通過(guò)基因工程技術(shù)改造納豆激酶 的基因,得到產(chǎn)酶量高的工程菌.納豆激酶作為微生物代謝 產(chǎn)物,只要有高活性的菌種,生產(chǎn)工藝條件成熟,就可實(shí)現(xiàn)大 規(guī)模生產(chǎn),而且其發(fā)酵原料來(lái)源廣,價(jià)格低廉,生產(chǎn)周期短,產(chǎn) 量高,且易于提取純化,其開發(fā)應(yīng)用前景十分廣闊.

5與其他枯草桿菌蛋白酶的同源性比較

納豆激酶同其他枯草桿菌蛋白酶具有很好的同源性,其 氨基酸序列同枯草桿菌蛋白酶E和枯草桿菌蛋白酶J比較而 言,分別僅有2個(gè)和4個(gè)氨基酸不同,納豆激酶成熟區(qū)域的一 級(jí)結(jié)構(gòu)同枯草桿菌蛋白酶E,枯草桿菌蛋白酶A分別具有 99.5%和99.3%的同源性.同其他枯草桿菌蛋白酶比較,納 豆激酶表現(xiàn)出同枯草桿菌蛋白酶Carlsberg69%的同源性;同 枯草桿菌蛋白酶BPN有85%的同源性;與枯草桿菌蛋白酶 DY有70%的同源性,其同源序列都在氨基酸活性中心周圍. 但烏赫特朗尼氏凝膠雙向擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)表明在NK,BPN和Cads— berg之間沒(méi)有交叉反應(yīng)_9J.

6納豆激酶的開發(fā)應(yīng)用現(xiàn)狀

目前,黑龍江省科學(xué)院應(yīng)用微生物研究所已篩選出產(chǎn)納 豆激酶活性高的菌株,探索出液體發(fā)酵罐生產(chǎn)納豆激酶以及 分離提取納豆激酶的生產(chǎn)工藝,并完成了對(duì)家兔動(dòng)脈血栓溶 解作用試驗(yàn),具有明顯效果.同時(shí)上海醫(yī)科大學(xué)分子遺傳室 已經(jīng)克隆了納豆激酶基因,完成了DNA測(cè)序,并獲得了納豆 激酶的基因工程菌,表達(dá)量可達(dá)40%以上,建立了用工程菌 生產(chǎn)納豆激酶的純化工藝.納豆激酶制劑恩開膠囊已處于中