 線粒體是支持細胞功能和生存的重要細胞器，其活性隨著年齡和疾病而下降。線粒體的核心功能是產生ATP，該過程的主要副產物是活性氧（ROS），ROS升高導致氧化應激是多種生理（正常衰老）和病理過程的共同特征。ROS調節生物過程的一個關鍵機制是蛋白質半胱氨酸殘基的可逆共價修飾。氧化半胱氨酸可以在同一蛋白質內部或兩個相鄰蛋白質之間形成二硫鍵，引起蛋白質復合物的氧化構象變化。蛋白質結構的氧化還原可以調控大分子復合體的組裝、成熟和穩定。 線粒體膜蛋白是線粒體內ROS修飾將氧化還原信號傳遞到胞質的理想蛋白靶點。線粒體的兩層膜緊密相連，被狹窄的膜間間隙(IMS)分隔。位于線粒體內膜(IMMs)和線粒體外膜(OMMs)上的蛋白質復合體可以形成跨雙層膜的超復合體。有趣的是，線粒體接觸位點和嵴組織系統(MICOS)復合體中的一種成分MIC19/CHCHD3已經被報道以依賴氧化還原的方式調節MICOS的穩定性。本研究作者Xinnan Wang之前已經證明了一種MICOS成分MIC60/Mitofilin與OMM蛋白Miro13在同一復合體中存在相互作用。Miro重要功能之一是將細胞器運動相關蛋白招募到線粒體表面并調節其運動。此外，Miro在啟動線粒體自噬，啟動組織線粒體內質網接觸，平衡細胞內離子、代謝物和類核穩態的線粒體特異性自噬中起著至關重要的作用。IMM蛋白MIC60和OMM蛋白Miro之間的這種連接理論上可以將線粒體內氧化狀態的信號轉導到胞質中。然而，其中的詳細機制有待研究。 2021年9月9日，斯坦福大學醫學院Xinnan Wang團隊在Nature Metabolism 上發表了題為《A mitochondrial membrane-bridging machinery mediates signal transduction of intramitochondrial oxidation》文章。文章以果蠅為模式動物發現MIC60隨著衰老表達上調和IMS結構域的半胱氨酸氧化水平上調，并能通過MIC60-DMiro復合體將線粒體的氧化信號傳遞給細胞，引起細胞氧化應激，該機制在衰老、帕金森綜合征（PD）和弗里德里奇共濟失調癥等線粒體氧化損傷相關的疾病中發揮作用；通過RNA干擾解聚MIC60-DMiro復合體可以改善細胞氧化，延長果蠅壽命，改善衰老、PD和FA的癥狀；最后，作者發現了MR3和MR5兩種Mrio1小分子抑制劑能改善PD和FA的癥狀。綜上所述，本文發現了MIC60-DMiro是線粒體內氧化信號向胞質轉導的新機制，為改善氧化應激相關疾病提供了新的靶點。  MIC60蛋白可以發生氧化構象變化人類MIC19蛋白通過在CHCH域的雙半胱氨酸-x9-半胱氨酸基序內形成兩個二硫鍵轉換成氧化構象。那么半胱氨酸氧化能否引起果蠅中同源的MIC60蛋白構象的改變呢？果蠅MIC60 (dMIC60)有四個半胱氨酸，10號和12號半胱氨酸在預測的線粒體定位信號序列，另外兩個（302和550）在dMIC60的膜間區域（IMS），302和550半胱氨酸形成二硫鍵可能導致dMIC60蛋白折疊。 為了探明這種可能性，作者使用還原劑二硫蘇糖醇和非還原劑甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺5000 (PEG-MAL)處理了15天齡果蠅的全身裂解液，二硫蘇糖醇可以打開二硫鍵并線性化蛋白質，使每個半胱氨酸質量向上偏移5 kDa，而不影響氧化的半胱氨酸。蛋白電泳顯示，dMIC60蛋白在非還原條件(PEG-MAL)下比還原條件(二硫蘇糖醇)下遷移更快，表明dMIC60含有氧化的半胱氨酸，并存在氧化的構象變化。用過氧化氫喂養2日齡的果蠅時，dMIC60在非還原條件(PEG-MAL)下比還原條件(二硫蘇糖醇)下遷移更快，表明dMIC60確實被氧化了。 為了證實dMIC60的氧化半胱氨酸形成了二硫鍵，作者采用了間接硫醇捕獲法檢測蛋白里的天然二硫鍵。作者在裂解物中添加三(2-羧基乙基)膦(TCEP)還原二硫鍵，然后用4-乙酰胺-4 -馬來酰二苯乙烯-2，2 -二磺酸(AMS)還原天然二硫鍵，最終使每個半胱氨酸添加0.5 kDa。作者發現，與對照組相比，15日齡果蠅或2日齡果蠅的dMIC60蛋白帶明顯上升，證實dMIC60形成了二硫鍵。用AMS直接處理2日齡的果蠅，其dMIC60條帶比用二硫蘇糖醇處理的高，沒有顯示二硫鍵形成。這些數據表明，dMIC60隨著年齡的增長而氧化。 為了證實半胱氨酸302和550之間形成了二硫鍵，作者構建了302和550半胱氨酸突變為絲氨酸(dMIC60-CS，CS)的轉基因果蠅，這樣302和550之間就不能形成二硫鍵。用過氧化氫飼喂dMIC60?-WT和dMIC60-CS果蠅，然后檢測dMIC60蛋白在非還原條件(PEG-MAL)下的遷移，發現氧化的dMIC60-WT比dMIC60-CS遷移得更快；用TCEP處理含有dMIC60-WT的果蠅，然后用AMS捕獲形成二硫鍵的半胱氨酸，這種處理持續導致dMIC60-WT帶向上移動。綜上所述，我們的結果表明，dMIC60的半胱氨酸302和550形成一個二硫鍵。  氧化構象促進了MIC60與Miro的物理結合作者之前發現內源性的人Miro1能與HEK293T細胞中的MIC60結合。通過共免疫沉淀法(co-IP)發現內源性的果蠅Miro (DMiro)和dMIC60存在于同一個復合物中。dMIC60的氧化還原狀態影響其與Miro的相互作用嗎？作者發現，在2日齡果蠅中，dMIC60氧化水平較低時，dMIC60與DMiro共免疫沉淀很少；過氧化氫喂養果蠅時，dMIC60和Miro的相互作用增強。此外，作者發現dMIC60-CS果蠅中dMIC60與DMiro結合的能力變弱。這表明，dMIC60的氧化影響其與DMiro的結合。 此外，作者發現飼喂氧化劑的dMIC60-WT果蠅中，內源性DMiro和dMIC60的蛋白水平增加。而在dMIC60-CS果蠅中，這種氧化誘導的蛋白質水平上調被阻斷了。這說明，dMIC60的氧化促進了它與Miro的相互作用，并穩定了dMIC60-DMiro復合物。  dMIC60-DMiro復合體受衰老影響氧化應激是正常衰老的標志。上文中作者發現dMIC60氧化水平隨年齡增加而上調。那么dMIC60-DMiro復合體在果蠅衰老期間是否發揮氧化還原傳感器的作用呢？Mito-Sox染色發現，與年輕果蠅相比，年老果蠅大腦中的線粒體ROS升高。對5日齡幼蠅和50日齡老年果蠅的蛋白組學檢測發現，抗氧化酶和應激反應蛋白的上調是老年果蠅蛋白譜的重要特征。Co-IP實驗也證明，果蠅中衰老會導致DMiro結合的dMIC60的水平上調；給果蠅飼喂抗氧化劑AD4時，DMiro和dMIC60的結合能力被削弱了。此外，老年果蠅的dMIC60和DMiro蛋白水平也輕度上調; AD4喂養能降低dMIC60和DMiro的蛋白水平。這表明，在衰老過程中，dMIC60氧化上調，增強了dMIC60與DMiro的相互作用以及dMIC60-DMiro復合物的穩定性。  dMIC60-DMrio復合體解聚可以延長果蠅壽命和健康壽命根據上述發現，作者推斷，在衰老過程中線粒體內的氧化還原狀態可以通過dMIC60的氧化水平和dMIC60-DMiro相互作用發送給細胞，最終導致細胞響應。那么阻斷dMIC60-DMiro相互作用或降低蛋白的表達水平能否延長果蠅壽命呢？ 作者在dMIC60缺失的果蠅中表達野生型dMIC60或抗氧化突變體dMIC60-CS, （dMIC60-CS不能與Miro結合）。作者發現，dMIC60的缺失導致果蠅蛹致死，表達dMIC60- WT或dMIC60- CS能使dMIC60缺失蠅存活到成年，而dMIC60-CS的果蠅的壽命明顯長于dMIC60-WT果蠅。此外，作者發現通過RNAi降低神經元中的DMiro水平（而不是腸道腸細胞、肌肉或全身的DMiro水平），可以顯著延長果蠅的壽命。在果蠅生命早期或晚期進行DMiro RNAi同樣有益。總的來說，這些結果表明dMIC60-DMiro復合體可以作為延長果蠅壽命的靶點。 削弱dMIC60-DMiro的相互作用是否會延長果蠅的健康壽命呢？作者發現，與dMIC60-WT的果蠅相比，dMIC60-CS的果蠅具有更好的運動能力和對抗氧化能力。神經元中的DMiro-RNAi也顯著改善了年齡引起的運動能力下降，并提高了果蠅抵抗氧化應激的能力。 綜上所述，阻斷dMIC60-DMiro復合體的相互作用可以延長果蠅的壽命和健康壽命。  靶向dMIC60-DMiro復合體可改善線粒體功能上述研究表明dMIC60-DMiro復合體在延長果蠅的壽命中有重要作用，然而其中的分子機制是什么？作者首先測量ATP水平來確定dMIC60對細胞能量穩態的影響，發現dMIC60-CS組總ATP水平高于dMIC60-WT組；在敲低成年果蠅神經元中dMIC60后果蠅全身ATP和頭部ATP水平顯著上升。Mito-Sox染色發現，和dMIC60-WT果蠅相比，dMIC60-CS果蠅ROS水平更低；神經元中DMiro-RNAi顯著降低了老年果蠅大腦中的ROS水平。這表明dMIC60功能缺失使果蠅的氧化應激得到了緩解。 接下來，作者通過四甲基羅丹明甲酯(TMRM)染色測定了果蠅多巴胺能(DA)神經元中線粒體膜電位（線粒體ATP合成的驅動力），發現老年果蠅大腦的膜電位降低，DMiro RNAi可以改善膜電位，表明DMiro RNAi可以改善年齡的增長引起的線粒體功能受損。在體外對完整的果蠅大腦的seahorse檢測發現衰老顯著降低了基礎耗氧率(OCR)和細胞外酸化率(ECAR)，表明有氧和無氧呼吸都隨著年齡的增長而減弱。值得注意的是，在神經元中表達DMiro RNAi可以改善老年果蠅的OCR和ECAR，使其完全恢復到了年輕果蠅的水平。 最后，作者評估了自噬的作用。作者在TH-GAL4驅動的DA神經元中表達Mito-GFP，然后對泛素和自噬啟動的關鍵蛋白p62進行免疫染色。作者發現，與年輕果蠅相比，年老果蠅大腦中與p62共定位的Mito-GFP減少，表明隨著年齡的增長，線粒體啟動自噬的能力變弱。一致的是，蛋白質組學結果顯示，與年輕果蠅相比，年老果蠅線粒體基質蛋白有顯著的積累，這可能是自噬受損的結果。有意思的是，DMiro RNAi顯著增加了年老果蠅中與p62和泛素共定位的Mito-GFP，這表明DMiro RNAi提高了線粒體自噬效率。 綜上所述，解離dMIC60-DMiro復合體可促進細胞呼吸，改善線粒體功能，減輕氧化應激。  dMIC60-DMiro在帕金森綜合征和弗里德里奇共濟失調癥中發揮重要作用ROS是氧化應激相關的重要物質。α-Syn是Lewy小體的主要成分，Lewy小體是帕金森病(PD)的重要病理特征，α-syn的積累會增加線粒體ROS的產生并損害線粒體功能。作者早先發現，野生型α-syn和A53T突變的致病性α-syn的上調會導致Miro蛋白的升高，最終減緩線粒體自噬。 在本研究中，作者觀察到表達人α-syn-A53T的果蠅的大腦中ROS水平升高。Co-IP實驗表明，和正常衰老的果蠅一樣，表達α-syn-A53T的年輕果蠅中dMIC60與DMiro相互作用上調。這表明dMIC60-DMiro氧化還原傳感器對果蠅的α-syn毒性有響應。 有趣的是，這兩者之間存在時間依賴性。DMiro和dMIC60結合的增加出現(第5天)，隨后是DMiro蛋白上調(第15天)和DA神經元丟失(第40天)，提示分子相互作用最終使DA神經元對死亡更敏感。為了進一步確定dMIC60-DMiro與PD的關聯，作者在PD20 α-syn果蠅模型中敲除DMiro，發現DMiro敲除可以減輕年齡依賴性的運動能力下降，并保護DA神經元。 線粒體功能障礙導致的氧化應激是許多兒童期線粒體疾病的特征。弗里德里奇共濟失調癥(FA)是一種早發常染色體隱性遺傳疾病，是由編碼線粒體定位蛋白(frataxin)的FTX基因GAA重復序列的擴增引起的。該突變減少frataxin蛋白表達并破壞線粒體功能。作者使用frataxin 正交缺陷的FA果蠅疾病模型(Fh)探索了dMIC60-DMiro與FA的關系，發現Fh果蠅大腦中的線粒體ROS水平顯著升高。在Fh果蠅的全身裂解液中，DMiro和dMIC60表達上調，結合增加。這表明，氧化還原依賴的dMIC60-DMiro機制在frataxin缺乏時發揮作用。在Fh果蠅中，表達dMIC60-WT會導致成蟲全部致死(存活率為0)，而表達dMIC60-CS則不會（成蟲存活率為100%)，這表明dMIC60-DMiro復合體在FA發病中發揮作用。  抑制Miro對果蠅氧化應激疾病模型有益上述研究表明dMIC60-DMiro通路在衰老、PD和FA等多種氧化相關疾病中發揮重要作用，這提示對該通路的藥理學干預可能提供一種共同的治療策略。作者之前已經發現了一些靶向人類Miro1的小分子，并且Miro1抑制劑3、4、5、6(MR3、-4、-5、-6)喂養野生型果蠅會部分降低DMiro蛋白水平。值得注意的是，MR3、MR4和MR5結構相似，這表明它們屬于同一類化合物。 為了證實這些小分子可以與Miro1結合，作者在體外使用人類Miro1蛋白和MR3進行了熱位移分析，發現MR3引起了Miro1蛋白熔化溫度的劑量依賴性下降。這表明MR3直接與Miro1結合。接下來，作者在PD模型中測試了這些小分子，發現MR5治療顯著抑制了PD果蠅的年齡依賴性DA神經元損失和運動能力下降，PD人類神經元模型中也在MR5治療中獲益。在PD患者的iPSC來源的DA神經元測試中，作者發現恰當MR3與MR5治療可以完全緩解DA神經元的應激性變性。同時，MR3和MR5還能改善FA果蠅的運動能力。這表明MR3/5可能是有一種治療PD和FA的潛在療法。最后，作者給野生型果蠅喂食MR3或MR5，發現兩種化合物顯著延長了果蠅的壽命，MR5還提高了野生型果蠅的ATP總產量。 綜上所述，MR3和MR5可以作為緩解多種氧化應激相關疾病的先導分子。  總 結線粒體是產生ROS的主要場所，然而從線粒體基質到細胞胞質的氧化還原信號轉導的分子途徑尚不明確。本文中作者報道了一個由內而外的線粒體氧化還原信號轉導途徑。線粒體膜內蛋白MIC60的半胱氨酸氧化，觸發二硫鍵的形成、MIC60與線粒體膜外蛋白Miro的物理結合。兩者的結合最終抑制細胞自噬，損傷細胞呼吸，引起氧化應激。阻斷MIC60-Miro相互作用或者通過基因或藥理學干預降低蛋白表達水平，可以延長健康果蠅的壽命和健康壽命，并對帕金森病和弗里德里奇共濟失調的氧化應激相關疾病模型有益。該發現為抗氧化應激的常見治療策略提供了分子基礎。 文/阿司匹林 SHMS 責編/Jane 原文鏈接： https://www./articles/s42255-021-00443-a |
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