【原】7+單基因腫瘤的生信思路，告訴你如何選對基因發高分文章！

今天給同學們分享一篇關于單基因腫瘤的生信文章“ Molecular Characteristics, Clinical Significance, and Cancer Immune Interactions of Angiogenesis-Associated Genes in Gastric Cancer ”，這篇文章于2022年2月發表在 Front Immunol 雜志上，影響因子=7.561。在這項研究中，EVA1B是一種蛋白質編碼基因，是EVA1A基因的關鍵參數。本文通過研究探討EVA1B在結直腸癌（CRC）進展和預后中的作用。

1. EVA1B在泛癌中的生信分析

圖1描述了本研究的工作流程。與相應的正常組織相比，EVA1B（即FAM176B）在大多數腫瘤類型中的表達顯著增加，包括BLCA、BRCA、CHOL、COAD、ESCA、GBM、HNSC、KIRC、LIHC、PRAD、READ、STAD和THCA（圖 2A）。不同的是，在CESC、KICH、KIRP和UCEC中研究了下調的EVA1B。DNA甲基轉移酶在改變染色質結構和基因表達中發揮關鍵作用。作者注意到EVA1B在大多數腫瘤類型中與四種主要的DNA甲基轉移酶（包含DNMT1、DNMT2、DNMT3A和DNMT3B）呈現負相互作用（圖 2B）。此外，EVA1B與各種腫瘤類型的DNA錯配修復基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2和EPCAM）呈負相關（圖 2C）。M6A甲基化代表最常見的RNA修飾，它影響腫瘤進展的復雜性。作者專注于CRC中EVA1B與m6A調節劑的相互作用。根據EVA1B表達的平均值，將CRC患者分為高和低EVA1B表達亞群。如圖2D所示，下調的EVA1B與大多數m6A調節劑相關，如CBLL1、VIRMA、METTL14和RBM15。TMB成為對免疫檢查點阻止敏感的可靠生物標志物。在圖2E中，EVA1B在THYM和LGG中與TBM呈現出非常積極的相互作用。相反，它與BRCA、CESC、ESCA、HNSC、STAD和UCEC的TMB呈負相關。作者注意到THCA、BLCA、DLBC、HNSC、KIRC 和PRAD中EVA1B與MSI的正相關，但在COAD、READ、STAD和UCEC中與MSI負相關（圖 2F）。之后作者分析了EVA1B在泛癌中的免疫學特征。生信分析表明，EVA1B與泛癌的免疫細胞浸潤（圖2G）、MCH分子（圖2H）、趨化因子（圖2I）、免疫刺激因子（圖2J）、受體（圖2K）和免疫檢查點分子（圖2L）顯著相關。

圖1 本研究的工作流程

圖2 泛癌中EVA1B的表達、遺傳以及免疫學特征

2. EVA1B的預后意義及其與CRC藥物敏感性的關系

作者還關注EVA1B在CRC中的生物學作用和意義。作者結合了TCGA項目的COAD和READ數據集，并刪除了批處理效果（圖 3A、B）。生存分析表明，高EVA1B表達的患者比低EVA1B表達的患者OS結果更差（圖 3C）。靶向治療在CRC管理中發揮關鍵作用，歸因于CRC異質性的基因改變與對靶向治療的反應相關。仍然非常缺乏用于靶向治療的可靠預測生物標志物。因此，作者評估了EVA1B表達是否與藥物敏感性相關。因此，EVA1B與對博來霉素、樂伐替尼、唑來膦酸鹽、氟尿苷、米托蒽醌、辛伐他汀、拓撲替康和達沙替尼的敏感性呈正相關（圖 3D）。不同的是，EVA1B表達與CRC中對尼羅替尼、他莫昔芬、帕比司他、多西他賽、長春瑞濱、克唑替尼、乙炔雌二醇和紫杉醇的敏感性呈負相關。因此，EVA1B可能是上述藥物的預測標志物。

圖3 EVA1B的預后及藥物敏感性

3. EVA1B在CRC中的免疫學和生物學意義

作者的ssGSEA結果表明，在高EVA1B表達亞群中大多數免疫細胞的浸潤水平顯著增加（圖 4A）。此外，高EVA1B表達與增加的基質和免疫評分以及降低的CRC中的腫瘤純度相關（圖 4B）。在高EVA1B表達亞群中，癌癥免疫周期中大多數步驟的活性顯著增強（圖 4C）。作者還研究了高EVA1B表達亞群中免疫激活過程和基質激活過程的活性增加（圖 4D）。此外，在CRC標本中評估了EVA1B表達與癌癥免疫周期和已知生物學過程的相互作用。在圖4E中，EVA1B表達與癌癥免疫周期中的大多數步驟以及免疫和基質激活過程呈正相關。

圖4 EVA1B在CRC中的免疫學和生物學意義

4. EVA1B與CRC突變的關系

在圖5A中，作者評估了高和低EVA1B表達亞群中體細胞突變的患病率。APC、TP53和TTN位居前三個突變基因。然而，在高和低EVA1B表達亞群中沒有研究體細胞突變的顯著差異。GISTIC 2.0結果表明，與低EVA1B表達亞群（圖 5D、E）相比，擴增和缺失在高EVA1B表達亞群（圖 5B、C）中顯示出更高的頻率。此外，作者根據像差的幅度和它們在CRC標本中的發生頻率計算了G分數。經過比較，突變發生在高EVA1B表達亞群的更多區域（圖 5F，G）。

圖5 EVA1B與CRC個體中的突變研究和信號通路的關聯

5. 與 EVA1B 相關的信號通路

作者進一步分析了通過GSEA涉及EVA1B的信號通路。在圖 5H中，EVA1B的高表達與細胞粘附分子（CAM）、趨化因子信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、利什曼原蟲相互作用、白細胞跨內皮遷移和VEGF信號通路呈正相關。同時，EVA1B低表達與細胞周期、同源重組、錯配修復、核苷酸切除修復、卵母細胞減數分裂和剪接體呈負相關（圖 5I）。以上數據表明EVA1B參與了多個致癌途徑，說明了EVA1B的致癌作用。

6. EVA1B衍生基因的鑒定及其生物學意義

作者確定了CRC個體中的602個EVA1B衍生基因。進一步研究了它們的生物學意義。根據GO注釋結果，EVA1B衍生基因主要與免疫反應相關。此外，EVA1B衍生基因與致瘤通路和免疫激活通路存在顯著的相互作用（圖 6A-B）。總體而言，EVA1B衍生基因可能在CRC進展中發揮顯著作用。

圖6 構建CRC預后基因組模型

7. 用于CRC預后的EVA1B衍生基因組模型

使用單因素Cox回歸模型，總共有66個EVA1B衍生基因與CRC患者的預后顯著相關。通過隨機生存森林生信分析，作者對上述預后EVA1B衍生基因的相對重要性進行了排名（圖 6C）。作者確定了六個特征EVA1B衍生基因，包含IGFBP3、EGFL7、SULT1B1、MMP1、CYP2W1以及ISYNA1（圖 6D）。在此基礎上，進行多因素Cox回歸生信分析，根據平均值將CRC患者分為高風險和低風險亞群（圖 6E）。生存分析發現，低風險CRC個體表現出顯著的生存優勢（圖 6F）。然而，在高風險和低風險亞群之間沒有注意到生存狀態的明顯差異（圖 6G）。此外，IGFBP3、EGFL7、SULT1B1、MMP1、CYP2W1以及ISYNA1的表達異質性顯示在兩個亞群中（圖 6H）。ROC曲線證實EVA1B衍生的基因組模型在估計1年、3年和5年OS概率方面具有很好的效力（圖 6I）。

8. 驗證EVA1B衍生的基因組模型在CRC中的預后意義

除OS外，作者的分析表明，與TCGA隊列中的低風險亞群相比，高風險亞群表明DSS和PFS結局更不理想（圖 7A、B）。EVA1B衍生的基因組模型的預后意義在外部隊列中得到驗證。作者的數據證實，高風險評分可預測GSE14333、GSE39582和GSE87211數據集中的不利OS結果（圖 7C-E）。

圖7 驗證EVA1B衍生的基因組模型在CRC中的預后意義

9. EVA1B衍生的基因組模型預測CRC患者的藥物反應

進行了進一步的生信分析以揭示這種EVA1B衍生的基因組模型是否可以預測CRC個體的藥物反應。在圖8A中，作者注意到高風險組與低風險組相比，舒尼替尼和多西他賽的估計IC50顯著降低，表明高風險亞群對舒尼替尼和多西他賽的敏感性更高。同時，低風險組顯示索拉非尼和吉西他濱的估計IC50顯著降低，表明低風險亞群更有可能對索拉非尼和吉西他濱有反應。作者還評估了EVA1B衍生基因與藥物反應的相互作用。結果，MMP1與光神霉素、放線菌素D、縮肽和高靈芝堿的IC50呈負相關；EGFL7與雷替曲塞、吉西他濱、阿糖胞苷和TFdU的IC50呈正相關；IGFBP3與lenvatinib和JNJ-42756493的IC50呈正相關，但與LEE-011、cobimetinib和selumetinib的IC50呈負相關；CYP2W1與替加氟和氟尿嘧啶的IC50呈正相關（圖 8B）。這些數據表明EVA1B衍生的基因可能與對上述藥物的敏感性有關。

圖8 EVA1B衍生的基因組模型可預測CRC患者的藥物反應

10. 建立可靠的列線圖預測CRC預后

單因素Cox回歸生信分析揭示了年齡、分期、T、N、M和EVA1B衍生的風險評分與CRC預后的顯著關聯（圖 9A）。其中，年齡、T和EVA1B衍生的風險評分作為CRC的獨立預后指標（圖 9B）。通過整合上述三個獨立的預后指標，本研究利用列線圖來估計CRC患者的生存結果（圖 9C）。這個EVA1B衍生的風險評分對1年、3年和5年OS持續時間的預測貢獻最大。ROC曲線證實了在預測患者生存結果方面的理想功效（圖 9D）。此外，作者使用校準曲線評估了列線圖的預測性能。作者的數據表明，該列線圖預測的1年、3年和5年接近實際生存期（圖 9E-G）。上述數據表明該列線圖具有出色的預測能力。

圖9 建立可靠的列線圖用于預測CRC預后

11. 涉及EVA1B衍生的基因組特征的分子機制

作者進一步研究了涉及EVA1B衍生的基因組特征的分子機制。如圖10A所示，G2M檢查點、mTORC1信號、MYC目標、DNA修復和氧化磷酸化等在低風險亞群中表現出更高的活性。同時，P53通路、TGF-β信號通路、細胞凋亡、Hedgehog信號通路、EMT、Notch信號通路和血管生成等高危亞群的致瘤通路顯著激活，表明高危亞群的生存結果不佳。此外，免疫激活途徑如同種異體移植排斥、炎癥反應和補體在高危亞群中被顯著激活。

圖10 EVA1B衍生基因的免疫細胞浸潤

12. EVA1B衍生基因的預后意義及其與m6A甲基化和免疫細胞浸潤的相互作用

圖10B表明TRADD、MXD4、NR1H2、EVA1B和C11orf68是CRC結果的風險因素。此外，作者研究了上述EVA1B衍生基因與m6A調節因子ALKBH5和RBM15B呈正相關，但與CRC中的其他m6A調節因子呈負相關（圖 10C）。在圖10D中，這些EVA1B衍生基因與激活的CD4+ T細胞、效應記憶CD4+ T細胞、記憶B細胞和2型T輔助細胞呈負相關，但與CRC中的其他腫瘤浸潤免疫細胞呈正相關。圖10E顯示了CRC個體的藥物敏感性、預測性免疫反應和風險狀態之間的關聯。

13. EVA1B過度表達與CRC腫瘤發生和CRC患者預后不良相關

對來自19名肝轉移CRC患者的對原發性CRC、相應的非癌性和匹配的肝轉移標本進行EVA1B IHC。研究結果表明，與相應的非癌性正常組織相比，EVA1B在原發性CRC組織中過表達。此外，EVA1B在肝轉移樣本中的表達水平與匹配的原發性CRC組織中的表達水平相似，但沒有統計學意義（圖 11A、B）。生成KM生存曲線以探討EVA1B在這131例CRC患者中的預后價值。研究結果表明，與EVA1B低表達水平的患者相比，EVA1B高表達水平的CRC患者的OS較差（圖 11C）。EVA1B表達的AUC值表明EVA1B準確地區分高表達組和低表達組（圖 11D）。進行了單因素和多因素Cox回歸生信分析，表明EVA1B通過調整分期、性別、位置、分化、分期、CEA和CA199作為預后因素是獨立的（圖 11E、F）。

圖11 EVA1B表達與CRC腫瘤發生和CRC患者的不良預后相關