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    細胞流式圖,你都看懂了嗎?

     GCTA 2022-06-24 發布于貴州

    流式圖最常用的是:直方圖、散點圖、等高線圖。

    流式通道

    流式通道分散射光通道熒光通道:散射光通道有兩個,FSC和SSC通道;

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    FSC(Forward scatter),即前向角散射,它的值代表細胞的大小。細胞越大,背景墻上留下的陰影就越大。

    SSC(side scatter, SSC),即側向角散射,它的值代表細胞的顆粒度(granularity)。反應細胞內部細胞器或者顆粒性物質分布規則,細胞表面突起。

    一般在硏究細胞樣品時首先關注FSC-SSC散點圖(不需要標記任何熒光素偶聯抗體),x軸代表FSC值,y軸代表SSC值,分別代表細胞的大小和顆粒度這兩個基本的物理特征,所以樣品的FSC-SSC散點圖又稱為樣品細胞的 “物理圖”。

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    熒光通道表示的不是細胞特有的物理特征,而是其化學特征。

    如需檢測樣品中是否有細胞表達某分子,則需標記熒光素偶聯的該分子抗體,熒光素被相應的激光激發后產生熒光,該熒光信號通過光路系統被相應的熒光通道接收。

    熒光通道值反映接收到的熒光信號的強弱,從而反映細胞上結合的熒光素的量,進一步反映細胞上表達該分子的數量,最后間接反映細胞表達某分子這一化學特征

    不同細胞群的FSC值和SSC值最多相差幾倍,而熒光信號強弱之間一般相差很大,陰性細胞與陽性細胞之間、強陽性與弱陽性之間有時可以相差幾十倍、幾百倍,甚至幾千倍,呈指數關系。所以,流式圖數軸上FSC值和SSC值以“一般數序形式”表示,而熒光通道值常以“對數形式”(logarithmic scale)表示,在識圖時需要注意數軸的表示形式。當然,并不是所有的熒光通道值都以“對數形式”表示,當熒光信號值相差不多時,也可以“一般數序形式”表示,如P染色檢測細胞內DNA含量以及Hoechst33342染色分析和分選側群干細胞時,均以“一般數序形式”表示。


    1. 直方圖(一個通道的信息)

    流式直方圖形成的原理與統計學中的直方圖相似,是在統計學直方圖的基礎上進一步發展而成的。流式直方圖的x軸表示一個通道的值,y軸表示細胞數量。

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    流式直方圖雖不是如此簡單,但是基本原理是相同的。流式直方圖是在此統計直方圖的基礎上,使統計區間不斷地縮小,縮小到甚至可以認為一個值就是一個統計區間,使統計的細胞數量不斷地增加,增加到以萬計,甚至以十萬計時,相鄰的小統計區間內的細胞數相差不多,這時的直方圖好像是由光滑的曲線所圍成的。

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    2. 流式散點圖同時顯示2個通道的信息

    x軸表示一個通道的值,y軸表示另一個通道的值,圖中每一點代表一個細胞

    與流式直方圖相比,流式散點圖能夠同時表示兩個通道的值,能夠更加直觀地表示細胞的信息,所以流式散點圖更加直觀和常用。更易于細胞分群、分類,以及確定比例關系等。

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    正常人外周血白細胞FSC-SSC散點圖,中性粒細胞又大又復雜。

    一般在流式分析過程中,先利用FSC-SC物理圖根據細胞的大小和顆粒度將細胞進行分群,然后根據目標細胞處于哪個群體,再將該群體細胞設門(set gate),進一步分析該群體中的目標細胞

    門(gate)是流式分析過程中一個較為重要的概念,流式分析時有時不希望所有的樣品細胞都顯示于流式圖中,而是希望只顯示感興趣的細胞,排除其他非相關細胞的干擾,使顯示的信息更加直觀,更具有針對性

    流式細胞術散點圖參數FSC-A與FSC-H中的A是area的縮寫,H是height的縮寫。這是機器在記錄信號時所采用的參數(不顯示在用戶界面,在調試機器的時候可以顯示)。每個細胞通過激光的時候,機器都會記錄一個波狀信號(一個拱形的信號),H就是這個拱的高度(代表的是信號的強度),A就是這個拱的曲線下面積,代表信號強度和細胞大小的關系。其實還應該有一個參數W,是width的縮寫,是這個拱的寬度,代表細胞通過激光束所花的時間

    散點圖通常用于顯示和比較數值。例如科學數據、統計數據和工程數據。當要在不考慮時間的情況下比較大量數據點時,請使用散點圖。散點圖中包含的數據越多,比較的效果就越好。氣泡圖要求每個數據點具有兩個值(探頂值和探底值)。對于處理值的分布和數據點的分簇,散點圖都很理想。如果數據集中包含非常多的點(例如,幾千個點),那么散點圖便是最佳圖表類型。在點狀圖中顯示多個序列看上去非常混亂,這種情況下,應避免使用點狀圖,而應考慮使用折線圖。

    3. 流式等高線圖(同時顯示2個通道的信息

    流式等高線圖與流式散點圖相似,一張流式等高線圖也能同時顯示兩個通道的信息,所不同的是,它借助地理等高線圖的形式。地理等高線圖用封閉的環線代表海拔高度相同的地方,環線聚集越多,表示海拔高度變化越快,環線的中央區域表示海拔最高或者最低的區域。

    流式等高線圖借助地理等高線圖表示細胞的密集程度,流式等高線圖的環線代表的是細胞密度相同的區域,所以,環線聚集越多的地方表示此區域細胞密度變化越快,細胞最稀疏的地方還是用散點表示,環線的中央區域代表細胞聚集的中心。

    流式等高線圖的意義和實際應用與流式散點圖較為相似,可以看作是流式散點圖的一個變體。相比之下,流式散點圖更為直觀,所以應用也更為廣泛。

    當然,流式等高線圖也有其自身的優點,它較能直觀地體現細胞群的集中點,等密度環線的中央區域代表一個細胞群的集中點,一般代表一個細胞群,所以在某些情況下,流式等高線圖比流式散點圖更能直觀地體現細胞的分群。

    下圖顯示的是正常C57小鼠脾臟淋巴細胞分群的流式等高線圖

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