干細胞與再生醫學研究進展

干細胞與再生醫學研究進展

王立賓, 祝賀, 郝捷, 周琪     

摘要：干細胞具有分化成為體內所有類型細胞的能力，因此，其在再生醫學治療、體外疾病模擬、藥物篩 選等方面具有廣闊的應用前景。干細胞技術在近些年取得了突飛猛進的發展，特別是誘導多能性干細胞的出現 使干細胞領域經歷了一場巨大的變革。我國干細胞研究在這場干細胞技術變革中取得了多項重大成果，逐漸成 為了世界干細胞研究領域中的重要力量。本綜述著重介紹近幾年來，主要是誘導多能性干細胞技術出現之后， 我國在干細胞和再生醫學領域取得的重要進展，主要涵蓋誘導多能性干細胞、轉分化、單倍體干細胞以及基因 修飾動物模型和基因治療等方面。

關鍵詞： 干細胞    誘導多能性干細胞    轉分化    單倍體干細胞    CRISPR/Cas9    

Progress in stem cells and regenerative medicine

Libin Wang, He Zhu, Jie Hao, Qi Zhou     

Abstract: Stem cells have the ability to differentiate into all types of cells in the body and therefore have great application potential in regenerative medicine, in vitro disease modelling and drug screening. In recent years, stem cell technology has made great progress, and induced pluripotent stem cell technology revolutionizes the whole stem cell field. At the same time, stem cell research in our country has also achieved great progress and becomes an indispensable power in the worldwide stem cell research field. This review mainly focuses on the research progress in stem cells and regenerative medicine in our country since the advent of induced pluripotent stem cell technology, including induced pluripotent stem cells, transdifferentiation, haploid stem cells, and new gene editing tools.

Keywords: stem cells    induced pluripotent stem cells    transdifferentiation    haploid stem cells    CRISPR/Cas9    

干細胞是一類具有自我更新和多向分化能力的細胞，包括從體內胚胎分離獲得的胚胎干細胞和體外誘導獲得的多能性干細胞，以及成體干細胞。干細胞是進行細胞多能性維持機理研究、體細胞重編程機制研究和疾病發病機制研究等基礎研究的重要研究對象。同時，干細胞也作為遺傳性疾病治療藥物篩選、體外器官構建的“種子”細胞，在疾病治療和再生醫學治療中具有重要價值。近些年，我國科學家在干細胞領域的很多方面都取得了很大的進展，特別是在誘導多能性干細胞與重編程、轉分化、單倍體干細胞、成體干細胞與生物材料的結合、基因修飾動物模型及基因治療等方面尤其突出。我國科學家做出的這些有世界影響力的工作極大地推進了國際干細胞的研究，也為我國在干細胞研究中贏得了話語權，使我國向干細胞研究強國邁進。

1 誘導多能性干細胞

2006年，山中伸彌研究組首先發現用4個轉錄因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc即可將體細胞重編程為多能性干細胞，即誘導多能性干細胞 (Induced pluripotent stem cells,iPSCs)^[1]。誘導多能性干細胞有效地解決了胚胎干細胞 (Embyonic stem cells,ESCs) 所面臨的倫理爭議和免疫排斥的問題，為干細胞研究打開了一扇新的門。但是iPSCs出現以后一直無法像胚胎干細胞那樣通過四倍體補償得到發育的個體，因此iPSCs能否通過多能性的金標準，發育為體內所有類型的細胞成為領域內極具有挑戰性的問題。為了回答這一問題，我國科學家通過建立新的誘導培養體系，成功通過四倍體補償技術獲得了iPSC小鼠及其后代^{[2, 3]}。這項工作充分證明了iPSCs的發育全能性，為iPSCs的臨床和基礎研究鋪平了道路。但是，并不是所有的iPSCs都具有完全的發育潛能，只有一小部分可以通過四倍體補償獲得iPSC小鼠，那么不同發育潛能的iPSCs是不是存在—些差異呢？我國科學家通過在分子水平上比較不同發育潛能的iPSCs，在世界上首次發現發育能力較低的iPSCs的Dlk1-Dio3印記基因表達異常，而具有四倍體發育能力的細胞Dlk1-Dio3印記區的狀態是正常的^[4]。這項工作第一次發現了區分不同發育潛能的iPSCs的標志，對于我們研究人的多能性干細胞的發育潛能具有極其重要的參考價值，成為了國際干細胞領域普遍認可的一個標準。iPSCs的誘導效率低下一直是限制iPSCs應用的一個重要因素，我國科學家發現維生素C可以顯著提高iPS誘導效率，并通過一系列工作揭示了它是如何通過修飾表觀遺傳狀態來影響重編程^{[5, 6, 7]}。在我國科學家工作的基礎上，有研究組發現維生素C的作用不只限于提高重編程的效率，對于重編程獲得的iPSCs質量也有很大的影響，添加維生素C可以有效地提高iPSCs的發育能力，維持iPSCs印記的穩定^[8]，因此，維生素C對于重編程中的效率和質量都是極其重要的。除了維生素C之外還有很多提高重編程效率的小分子相繼被發現，很多小分子可以在一定程度上替代某些重編程的轉錄因子，用小分子來減少或者完全替代轉錄因子的使用不但可以提高iPSCs的安全性，而且對于未來iPSCs的標準化應用都是具有極大價值的。雖然很多小分子可以有效提高重編程效率并可以替代某些轉錄因子，但是直到2013年，我國科學家才通過7個小分子的組合完全替代了轉錄因子將小鼠的體細胞誘導成了多能性干細胞，并且形成的多能性干細胞具有較高的發育能力^[9]。同時，該研究組在重編程機制研究中發現分化相關的轉錄因子可以替代多能性轉錄因子來誘導體細胞重編程，并提出了成體細胞向多能性干細胞轉化的分子調控模型^[10]。我國科學家以誘導多能性干細胞為工具發現了很多重編程的機制，同時也在以往工作的基礎上進一步發展了這項技術，推進了這項技術盡快走向臨床。

2 轉分化

在多能性轉錄因子的誘導下體細胞可以重編程為多能性干細胞，而在某些組織特異性的轉錄因子的作用下，一種類型的體細胞可以被直接重編程成為另一種類型的體細胞或者成體干細胞，這種技術被稱為轉分化。轉分化可以不經過多能性干細胞階段而將一種相對豐富易得的細胞轉變成為一種相對缺少卻具有重要功能的細胞，這樣就減少了腫瘤發生的可能性，同時轉分化的時間較短，對于急需細胞移植的病人來說可能是一種新的選擇。轉分化最早的研究源于2002年，科學家利用MyoD將成纖維細胞轉化成為成肌細胞^[11]。雖然轉分化研究出現較早，但是在誘導多能性干細胞出現之前這項技術發展緩慢，在iPSCs出現之后，轉分化研究才重新成為了大家關注的重點，各種類型的轉分化研究如雨后春筍一般出現，其中就有很多我國科學家的貢獻。我國科學家首先建立了神經干細胞轉分化的技術體系，成功將中胚層的睪丸支持細胞轉分化為神經干細胞，并且這種神經干細胞在體內和體外可以分化為多種類型的神經細胞^[12]，神經干細胞相對于神經元來說具有增殖能力和多向分化潛能，因此在臨床應用中可能具有更重要的價值。我國科學家在世界上率先將小鼠的成纖維細胞誘導成為了肝細胞，更加重要的是這種肝細胞移植到肝病小鼠體內之后可以挽救肝病小鼠的生命^[13]，這說明轉分化獲得的肝細胞在移植之后可以發揮正常肝細胞的部分或者全部功能，這為未來轉分化的臨床應用提供了重要的參考。同樣是肝細胞轉分化，我國科學家在后續的研究中成功通過轉分化獲得了肝前體細胞，以及人的肝樣細胞^{[14, 15, 16]}。但是，轉分化與誘導多能性干細胞一樣，需要借助于外源的轉錄因子實現細胞的命運轉換，而外源基因的導入也給轉分化獲得細胞的安全性帶來了潛在威脅，為了解決這一問題，我國科學家通過3個小分子化合物的組合結合低氧條件成功將小鼠以及人的體細胞轉分化成為神經前體細胞^[17]，這就有效地提高了轉分化獲得細胞的安全性，為提高轉分化研究的安全性提供了重要參考。我國科學家在轉分化方面的貢獻對于整個轉分化領域的前進起到了不可替代的推進作用，為轉分化的臨床前研究提供了重要參考。

3 成體干細胞與生物材料

成體干細胞是指在已經分化的組織中存在的具有自我更新和多能性的一類細胞，與胚胎干細胞相比具有來源廣泛、免疫排斥反應弱、致瘤風險低、倫理學爭議較少等優勢，給再生醫學帶來了巨大的希望。在細胞治療領域，成體干細胞有著良好的應用前景，目前應用較成熟的成體干細胞包括造血干細胞和間充質干細胞 (Mesenchymal Stem Cells,MSCs) 等，由于造血干細胞體外擴增的局限性，近年來MSCs在基礎研究和臨床應用中得到更多的關注。MSCs存在于多種組織中，并且在組織的損傷修復中起重要作用^[18]。雖然MSCs沒有胚胎干細胞分化潛能高，但MSCs具有其獨特的優勢。第一，MSCs沒有倫理因素的限制，可進行自體或異體的移植；第二，MSCs來源廣泛，幾乎所

有組織內都有間充質干細胞，并且取材時對機體損傷小，研究人員已經從多個物種的多種組織中分離得到MSCs^[19]；第三，MSCs具有強大的自分泌和旁分泌功能，可以分泌大量生物活性物質，在組織修復中起到營養支持和免疫調節作用^[20]。MSCs具有的這些優勢為其臨床應用奠定了基礎。因此，對MSCs開展全面深入的基礎研究和臨床前的疾病動物模型研究十分必要。干細胞臨床治療是否會引起免疫排斥反應是最為重要的問題，我國科學家對間充質干細胞與免疫系統的相互作用進行了系統的研究工作，闡明了間充質干細胞對免疫系統的調節機制，為間充質干細胞的臨床應用鋪平了道 路^{[21, 22]}。在此之后，MSCs在臨床應用上已經取得了一些成績，我國科學家已經開展利用間充質干細胞治療移植物抗宿主病 (GVHD)、再生障礙性貧血 (AA)、關節炎、系統性紅斑狼瘡等自身免疫疾病的研究^{[23, 24]}。除自身免疫疾病之外，也有研究發現，MSCs可以跨胚層分化，具有向內胚層和外胚層分化的能力。我國科學家利用間充質干細胞治療上皮損傷、肺纖維化、腦癱、老年癡呆、糖尿病、心血管疾病、肝臟疾病、燒傷和神經損傷等疾病^[25] (http:// clinicaltrials.gov/)。其中已經有一些MSC的臨床實驗在進行中，如用MSCs治療Ⅰ型糖尿病已進入Ⅰ期、Ⅱ期臨床試驗 (www.ClinicalTrials. gov (NCT00690066、NCT01068951))。

單獨的細胞移植存在組織內細胞活性降低、流失、擴散等問題，較難達到預期的治療效果。隨著生物材料的發展，起初我國科學家用小分子 (如bFGF、VEGF) 與生物材料結合在動物疾病模型中，取得了很好的治療效果^{[26, 27]}，之后人們開始將干細胞與生物材料相結合，我國科學家發現將間充質干細胞或小鼠胚胎干細胞與生物材料結合進行3D培養時干細胞的多能性優于2D環境中的細胞^{[28, 29]}，之后我國科學家又嘗試了許多干細胞與生物材料相結合的實驗。例如，中國科學院遺傳與發育研究所將MSCs與膠原材料結合移植入腦損傷模型的大鼠中，發現結合材料后細胞能更長久地在組織中發揮更好的修復作用^[30]。但是，當細胞與材料結合時，細胞將面臨一種新的環境，而材料本身的性質對細胞有著各種的影響，如pH、導電性、壓力和一些其他的刺激作用^[31]。因此，找尋一種與生理環境最接近、最安全的生物材料，是目前生物材料界所共同努力的方向?？傊?，我國科學家在再生醫學領域占據了舉足輕重的地位，推動了間充質干細胞在臨床上的應用，相信在不久的將來，我們的科學家定能更加成熟地運用成體干細胞治療各種疾病。

4 單倍體干細胞

單倍體細胞只有一套染色體，沒有等位基因的存在，因此它們在遺傳篩選、基因功能研究中具有重要的價值。單倍體在低等生物細菌和真菌中普遍存在，但是在哺乳動物中單倍體只存在于雌雄配子中，而雌雄配子不能在體外長期培養因而限制了它們在遺傳篩選方面的應用。在小鼠胚胎干細胞成功建系之后，科學家一直在嘗試建立小鼠或者其他物種的單倍體干細胞，但是一直沒有取得成功。直到2011年，英國科學家通過持續流式分選的方式才獲得了可以穩定傳代的小鼠單倍體干細胞，并且這些單倍體細胞具有多能性，體內體外可以分化為各個胚層的組織^[32]。但是這些工作中建立的單倍體干細胞都是孤雌單倍體干細胞，那么小鼠孤雄單倍體是否可以用類似的方式建立起來呢？我國科學家通過顯微操作的方式移除了卵細胞的細胞核而將精子注射到卵細胞之后成功建系獲得了孤雄來源的小鼠單倍體干細胞，并且非常有意思的是這些單倍體干細胞可以替代精子而使卵細胞受精并發育成為到期存活的小鼠^{[33, 34]}，因此這些孤雄單倍體干細胞不光在遺傳篩選上有明顯的優勢，而且可以替代精子迅速得到轉基因動物。我國科學家在掌握了單倍體建系和培養的技術之后，迅速將這項技術應用到了其他物種上，相繼建立了食蟹猴孤雌單倍體干細胞、大鼠孤雌和孤雄單倍體干細胞，并且證明這些單倍體在進行遺傳篩選方面確實有巨大的優勢^{[35, 36]}，這些工作大大拓展了單倍體干細胞的應用范圍，推動了這個領域的快速前進。單倍體干細胞作為一個新興的領域還存在大量未被解決的問題，我國科學家肯定會在這一領域中作出更多更大的貢獻。

5 基因修飾動物模型與基因治療

新的基因工具的開發對于基因功能的研究以及疾病的再生醫學治療來說都具有重要的意義。近些年，新發展起來的基因編輯技術包括鋅指酶、TALENs和CRISPR/Cas，其中CRISPR/Cas技術因其高效、設計簡單、易于操作等優點已經開始替代其他的基因編輯工具，成為現在基因操作的新寵兒^[37]。CRISPR/Cas本身是一種防御系統，能夠保護細菌和古生菌免受病毒的侵害。將CRISPR/Cas應用于非細菌細胞中需要滿足兩個條件，一個是Cas酶負責切割基因組的特定位置，另一個是導向RNA (gRNA) 負責識別基因組中的特定位置。2013年，科學家將這一系統應用于哺乳動物的基因組中，成功實現了CRISPR/Cas在哺乳動物中的應用^{[38, 39]}。我國科學家在世界上率先通過原核注射的mRNA到大鼠受精卵中，成功實現了大鼠中的多基因敲除^[40]。我國科學家還將這項技術成功應用到了白內障小鼠的治療，在受精卵的時候注射CRISPR/Cas9修復了小鼠白內障相關基因Crygc的突變，讓小鼠成功獲得了正常的視力^[41]。2014年，我國科學家利用CRISPR/Cas9技術獲得了轉基因猴子和豬模型的工作又發表在Cell等刊物^{[42, 43]}，這是世界上首次利用CRISPR/Cas9技術獲得的靈長類動物和大型經濟動物基因修飾的模型，在國際同行中引起較大轟動。CRISPR/Cas9可以在細胞上實現高效的基因打靶，因此，未來結合CRISPR/Cas9來修復病人iPSCs再進行細胞的分化和移植必將推動iPSCs的再生醫學應用。

除了在以上這些方面如DNA去甲基化的機制研究，將成體干細胞與生物材料結合應用治療不孕癥等等?？傊覈杉毎芯恳呀洺蔀閲H干細胞研究中一股無可替代的力量，并且必將發揮越來越重要的作用。

6 未來展望

干細胞技術經過幾十年的發展，其在技術體系上不斷出現突破和創新，特別是近些年誘導多能性干細胞技術的出現更為干細胞的基礎研究應用和臨床疾病治療插上了翅膀。來自于多種遺傳性疾病 (如早衰，鐮刀形細胞貧血癥和精神分裂癥等) 的病人的iPSCs在體外分化后可以很好地模擬這些疾病的發生過程^{[44, 45, 46]}，使科學家可以在體外觀察到這些疾病發生的完整過程，這就為深入了解這些疾病的發病機制，開發相應的治療性藥物提供了很好的參考。這方面的工作現在受到大家越來越多的關注，還有很多未知原因的復雜疾病可以通過疾病特異的iPSCs去探究其病因和治療方案，因此，利用疾病特異的iPSCs去研究疾病的機制會持續受到大家的關注。iPSCs技術之所以受到如此關注的一個重要原因是大家希望有一天可以利用這項技術去治療人類的疾病，iPSCs可以作為一種種子細胞被應用到再生醫學治療。

如今干細胞研究已經進入由基礎實驗研究向臨床治療轉化的關鍵階段。2011年，美國食品藥品監督局 (Food and Drug Administration,FDA) 批準了Geron公司利用少突膠質細胞治療急性脊髓損傷的GRNOPC1Ⅰ期臨床試驗；2012年，加拿大衛生部 (Health Canada) 批準了Osiris生產的干細胞藥物的上市銷售；目前臨床研究已經表明hESCs分化來的 RPE細胞能安全有效地治療AMD患者，并且18個移植患者中有13個得到了視力改善^{[47, 48]}，2013年，日本厚生勞動省的審查委員會批準了利用iPSCs開展視網膜再生的臨床研究。但是，目前美國國立衛生研究院 (National Institutes of Health,NIH) 登記的細胞系絕大部分由于未嚴格滿足臨床要求而不能應用于臨床^[49]。所以干細胞的使用需要經過嚴格的檢驗流程，首先，任何干細胞研究的開展都需要獲得倫理委員會的批準，干細胞需來源明確，應用于臨床前的整個培養過程中應在臨床級別的條件下進行，并定期進行內毒素、支原體和人源和動物源性的病毒等各項安全性檢測，確保干細胞的高純度、無污染、無致瘤性，并通過國家相關部門的復核后才能運用于臨床試驗。同時，由于需要修復某些遺傳性疾病的相關的基因變異，發展更加安全高效的基因編輯方式也是急需的，大力發展有關iPSCs安全性和有效性的研究必將對再生醫學治療產生積極的影響。

多能性干細胞治療并不是再生醫學治療的唯一選擇，很多重要的功能細胞已經通過轉分化的方式獲得，并且這些細胞在體內外都能夠發揮正常的功能，因此，利用轉分化得到更多的功能性細胞也是再生醫學治療的一項重要選擇。同時體內轉分化研究獲得的細胞證明比體外獲得的細胞具有更好的功能，同時這種細胞也更容易和體內其他細胞建立聯系^{[50, 51, 52]}，但是體內轉分化面臨效率低下，實驗體系不完善，并且體內定向導入基因比較困難等問題。因此，如果可以解決這些問題，那么轉分化研究一定會為很多急于進行細胞移植治療的病人帶來 福音。

但是與國際先進水平相比，我國在干細胞的基礎研究方面依然很薄弱，而這一方面也恰恰是現在國際干細胞領域中競爭最激烈的。像重編程機制的深入探索，干細胞多能性維持網絡的完善以及干細胞多向分化能力的挖掘這些方向將在相當長的時間內持續成為干細胞領域的研究熱點，如果我國能夠對干細胞領域持續加大投入，我國必然會在未來干細胞基礎研究方向上取得更大的突破。

綜上所述，干細胞研究是當前國際生命科學競爭的熱點，對我國廣大人民的再生醫學治療和提升我國醫藥產業的競爭力都具有重要意義。目前國際干細胞研究處于發展的早期階段，我國面臨著空前的機遇，并且也已經取得了很多重要的成果。但是面對國際干細胞領域的激烈競爭，我國也面臨著空前的挑戰，需要加快發展的步伐，使我國在這一領域獲得更多的話語權，同時推動干細胞盡快進入臨床。為了使我國干細胞臨床應用更具規范性和合理性，我國政府部門也相繼制定了干細胞管理制度 (《干細胞臨床試驗研究管理辦法》(試行)、《干細胞臨床試驗研究基地管理辦法》(試行)、《干細胞制劑質量控制和臨床前研究指導原則》(試行)) 征求意見稿。我們相信在不久的將來，隨著具體政策的出臺，我國干細胞的臨床應用會走上一個全新的時代，為廣大人民的健康事業作出貢獻。

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