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01、蛋白微陣列技術 雖然高通量的轉(zhuǎn)錄組核酸陣列可以比蛋白微陣列覆蓋更多的種類和數(shù)量，但是在細胞功能中起主要作用的是蛋白質(zhì)，因此蛋白微陣列技術的發(fā)展有望成為獲得更大的細胞功能尺度的新方法。蛋白微陣列技術被定義為：一種可以在單位區(qū)域內(nèi)打印大量微小斑點并可以進行后續(xù)蛋白檢測的技術。蛋白微陣列技術可以根據(jù)微陣列表面固定類型的不同進行如下分類： 固定某種蛋白，分析與其他蛋白的相互作用蛋白與蛋白的相互作用是發(fā)揮生物學功能最主要的機制之一，蛋白微陣列技術提供了一種高通量和特異性的方法。但蛋白與蛋白相互作用技術的輸出大多定性的，因此，它們在蛋白質(zhì)組時代扮演著“腳手架”信息的基本角色。但卻產(chǎn)生越來越詳細和可靠的生物模型。固定分析物(如樣本)，分析與檢測物(如抗體)的相互作用固定檢測物，分析與分析物的相互作用蛋白微陣列的分析物一般是指樣本，例如，來自結腸癌細胞系的細胞裂解液將作為分析物與檢測物反應。檢測物是對分析物有特異性結合的物質(zhì)，能與分析物特異性結合的抗體、適配體、小分子等都是檢測物。分析物和檢測物無論是被固定在基底上還是自由處在溶液中，反應都能在固相基底表面進行，特異性結合信號都能被檢測到。 d)(b)和(c)的組合 (b)和(c)的結合通常是指“捕獲抗體-抗原-檢測抗體”這樣的雙抗體夾心法ELISA(酶聯(lián)免疫檢測技術)。但是微陣列技術可以僅僅使用捕獲抗體或檢測抗體，而不需要ELISA那樣的抗體對。
02、基于反相蛋白微陣列技術的蛋白組學定量分析 在目前已知的蛋白組學定量研究中，抗體是一個主要的影響因子。基于抗體的芯片可分為之前描述的b)、c)、d)三種類型，檢測物一般是指抗體，分析物一般是指細胞裂解液等樣本。 正相蛋白微陣列(Forward Phase ProteinmicroArray，F(xiàn)PPA)是先將多種抗體打印在固相基底上，然后檢測細胞裂解液等樣本中的蛋白。
反相蛋白陣列技術(Revers Phase ProteinmicroArray，RPPA)是將細胞裂解液等樣本打印到固相基底上，然后用抗體檢測樣本中的蛋白。正好與正相蛋白微陣列技術相反。
RPPA技術流程：樣本類型可以是微生物、細胞系或者人組織活檢，需要經(jīng)過裂解;抗體需要提前篩選過并確認過抗體的特異性，可以通過最簡單的WB的方法，只有分子量正確且是單條帶的才能被認為是好的抗體;打印基底一般是硝酸纖維素覆蓋的玻片;打印儀一般是實心針的2470Arrayer;樣本被打印到基底上后，特異性的一抗與目標蛋白結合，再使用含有特殊標記的二抗進行信號檢測，采集到的圖像經(jīng)過軟件的自動化處理后輸出蛋白濃度信息。如下圖所示。
最初這項技術是由George Mason大學的研究人員Emanuel Petricoin和Lance Liotta研發(fā)的，他們也是這項技術的主要使用者，目前有3臺基于2470 Arrayer構建的RPPA平臺。在Gordon Mills和Rehan Akbanie領導下，MD安德森癌癥基因組中心專注于蛋白質(zhì)組學分析，其使用反相蛋白微陣列(RPPA)技術來研究從各種NCI項目中獲得的腫瘤組織，這些項目包括Exceptional Responders Initiative，ALCHEMIST精準醫(yī)學實驗，Cancer Driver Discovery項目，Cancer Trials Support Unit和癌癥治療評估項目。MD安德森擁有3臺2470Arrayer構建的RPPA平臺，運行超過了100000個樣本，并建立了高質(zhì)量的數(shù)據(jù)集，這些數(shù)據(jù)公眾也能使用。
盡管RPPA技術需要特異性的抗體，但它能夠檢測多種維度下的大量樣本的蛋白水平。但是，與抗體、重組蛋白溶液相比，蛋白混合物樣本是非常粘稠的。除此之外，蛋白網(wǎng)絡監(jiān)測研究的樣本需要在很多不同的時間點去收集。因此，樣本收集能力和粘稠樣本打印能力成為了RPPA技術的限制條件。 03、微陣列打印儀的發(fā)展 蛋白微陣列的制備離不開微陣列打印儀。目前微陣列打印儀根據(jù)針頭的結構不同大致可分為3種，包括裂隙針、噴墨(壓電)式、實心針。 裂隙針主要是在早期的雙色DNA微陣列中發(fā)揮了主要作用。這個概念是基于通過兩個檢測顏色的比例消除打印差異或打印的非線性問題，打印質(zhì)量并不是最佳的，并且打印針頭的設計也是比較復雜的。許多微陣列研究往往涉及打印稀釋曲線，理想情況下，梯度稀釋曲線應與分析物濃度呈明顯的線性關系。由于裂隙針內(nèi)部儲存一定量的樣本，所以裂隙針時不適合一個斑點一根針這種打印方式的，而且裂隙內(nèi)樣本的不斷減少所形成的容積變化導致了打印斑點的差異性。因此裂隙針的打印差異是不可能產(chǎn)生線性稀釋曲線的，裂隙針這種斑點的打印結果還需要其他獨立的技術來驗證。
噴墨式是起源于墨水打印技術，它們在打印生物材料時性能良好。噴墨式是通過電脈沖來控制分配，產(chǎn)生一致性的斑點。然而，這種打印方式并不能很好的打印粘性樣本，例如細胞裂解液或復雜混合物。此外，噴墨式的洗滌循環(huán)所需的時間是比較長的，并且對于含有非常多的樣本的大規(guī)模的微陣列，噴墨式是不適合的。
實心針打印方式相對而言是簡單的。針頭從微孔板中沾取樣本后將液滴沉積到打印基底表面，整個過程不涉及到其他的機械力。實心針微陣列最初是由GMS/Affymetrix 417的針環(huán)式打印的，實現(xiàn)方式是樣本在環(huán)內(nèi)形成一個半月形，實心針穿過這個半月形的樣本進行打印。這種方式優(yōu)勢之處在于打印粘性樣本，但是環(huán)內(nèi)的樣本殘留一方面導致了樣本的浪費，另一方面也加大了清洗的難度。另外也需要更高的打印通量和長時間打印時環(huán)境控制。
Quanterix(收購Aushon)公司的2470Arrayer是一款實心針接觸式微陣列打印儀器。針的外壁和針尖表面經(jīng)過了特殊的表面處理，當針沾取樣品后，由于針的外壁非常的光滑，只會在針頂端形成一個微滴。針尖上的微滴由于受到基底表面更大的表面張力作用，當實心針輕觸基底表面時，微滴便從針尖沉積到基底表面的指定位置上完成打印。
相比較于上述微陣列打印儀，基于實心針的2470 Arrayer具有以下優(yōu)勢： 針頭結構簡單，使用壽命久無空腔或管路的樣本浪費，尤其適用于單樣本單點打印無空腔容積變化影響，打印一致性高，可形成高密度打印針頭清洗簡單和充分與噴墨式相比，針頭數(shù)量調(diào)整更靈活尤其適用于細胞&組織裂解液等粘性樣本的打印 2470 Arrayer可同時支持100片玻片和30塊384或1536孔樣品板。2470在其嚴格的環(huán)境控制系統(tǒng)下，擁有極高的打印質(zhì)量和多達30000個點的高密度微陣列。憑借其實心針的結構，2470比現(xiàn)有的任何一款儀器都要更適用于粘性樣本的微陣列打印。 這些技術發(fā)展已經(jīng)改變了從微陣列蛋白組學實驗中所獲得的信息的質(zhì)量和數(shù)量。如圖3所示。
04、定量檢測的反相蛋白微陣列技術 實心針樣式的2470Arrayer的出現(xiàn)，實現(xiàn)了微陣列打印的高質(zhì)量和高密度。為了使得蛋白在室溫下是變性的和可溶的，通常會使用了改進過的粘稠的PB裂解液(含6MUrea、43.6nMDTT、2.7%Chaps 、1.3%Pharmalyte、 pH 8-10.5)。基于2470Arrayer打印后的斑點的CV<1%，免疫染色信號CV<13%，從而保證了在反相蛋白陣列技術中的線性稀釋要求。實際中，一個晚上2470可以打印50張玻片，每張玻片大于10000個點。微陣列的高通量使研究設計方案延伸到更多的維度。當使用針環(huán)打印方式時只能在一張玻片上打印幾百個點，而使用實心針的2470可以在每張玻片上打印30000多個點。技術上來講，可以在一張玻片上打印3000個樣本(每個樣本2倍稀釋成10個梯度)。為了從稀釋曲線中提取出所有的信息，通常使用劑量插值算法(DI25)，計算每條曲線大部分穩(wěn)定區(qū)域的相對值(信號強度25%的范圍)，這種算法用來評估不適合Logistic模型的曲線。RPPA技術大樣本數(shù)量的潛力使得時間間隔和劑量梯度的定量蛋白網(wǎng)絡監(jiān)測成為了可能。
RPPA技術是從微小組織中檢測多種蛋白的唯一方法。從手術切除的樣本中獲取的微解剖樣本經(jīng)過裂解后可以通過RPPA技術來發(fā)現(xiàn)特定疾病的生物標志物，但需要保證抗體的特異性。 RPPA最重要的一個應用是以定量方式監(jiān)測蛋白網(wǎng)絡信號動態(tài)。信號轉(zhuǎn)導蛋白是處于連續(xù)的動態(tài)變化中，會因為輸入類型、劑量、時間的變化而改變。盡管已經(jīng)有通過標記蛋白在單細胞水平上追蹤蛋白動態(tài)的報道，但是為了獲得一個完整的網(wǎng)絡動態(tài)，需要觀察多種蛋白的變化，而RPPA技術可以通過抗體檢測多種蛋白的動態(tài)變化，并且是同時和定量檢測。 反相蛋白陣列(RPPA)代表了一種功能強大的功能性蛋白質(zhì)組學方法，可以以經(jīng)濟有效、靈敏和高通量的方式在大量樣本中定量檢測幾百種選定的蛋白。這種基于抗體的定量檢測方法已被廣泛用于腫瘤發(fā)生和進展的的分子機制的研究，并且發(fā)現(xiàn)生物標志物及其作用機制。目前MD安德森癌癥中心的RPPA平臺已經(jīng)發(fā)布了458種針對特定蛋白的抗體，涵蓋所有主要的癌癥信號轉(zhuǎn)導通路。 癌癥蛋白質(zhì)組圖譜(The Cancer Proteome Atlas,TCPA)是一個側(cè)重反相蛋白微陣列(RPPA)的網(wǎng)站(http://)。其中包含兩個獨立的數(shù)據(jù)庫，第一個著眼于患者腫瘤的RPPA數(shù)據(jù)，其包含癌癥基因組圖譜中的32種癌癥類型約8000個樣本，另外約500個來自獨立患者隊列的樣本。第二個應用側(cè)重于癌細胞系的RPPA數(shù)據(jù)，包含19個譜系的>650個獨立細胞系。許多這些細胞系都有公開的高質(zhì)量DNA，RNA和藥物篩選數(shù)據(jù)。 TCPA提供各種分析和可視化模塊，幫助癌癥研究人員以有效和直觀的方式探索這些數(shù)據(jù)集。通過TCPA數(shù)據(jù)庫能夠分析RPPA蛋白與顯著體細胞突變基因的相關性，評估拷貝數(shù)變化，DNA甲基化和mRNA對蛋白質(zhì)的影響，能推斷miRNA對蛋白質(zhì)表達的調(diào)節(jié)作用，構建蛋白質(zhì)與通路的共表達網(wǎng)絡，并鑒定臨床相關的蛋白質(zhì)標志物。
05、RPPA抗體篩選的必要性 目前市場上有很多商業(yè)化的一抗，但一抗與抗原的特異性結合的真實性并不清楚。通常是通過跑電泳看下分子量是否正確，但這并不能完全確定抗體的特異性。嚴格的方法是當抗體結合抗原后，對抗原進行氨基酸測序，但這樣不能獲得與抗體結合的抗原表位信息。實際中，通常是通過WB實驗觀察抗體是否能在正確的分子量的位置與抗原結合形成單一的條帶。
目前，MD安德森已經(jīng)開發(fā)了458種適用于RPPA平臺的抗體，可在其官網(wǎng)下載抗體篩選表格，表格中標注了抗體的采購來源、貨號、屬源、適用評分、使用稀釋比、儲存條件等，如上圖所示。該抗體篩選表涵蓋所有主要的癌癥信號轉(zhuǎn)導通路。 06、癌癥的理論機制應用 研究學者已經(jīng)在信號轉(zhuǎn)導領域已經(jīng)進行了廣泛的腫瘤細胞的生化反應研究。不斷累積的數(shù)據(jù)結果可以讓研究者以理論方式設計反應模型，這已成為理解復雜生物系統(tǒng)的另一種方式。生化反應涉及到分子、細胞和環(huán)境之間高度復雜、非線性的相互作用。因此，基于理論方式建立的模型需要通過實驗數(shù)據(jù)進行測試，以了解這些模型的實用性，完整性和價值程度如何。
理論生物學中的實驗方法通常旨在識別系統(tǒng)的組分及其相互作用，并監(jiān)測干擾對這些組分的影響。蛋白質(zhì)在信號轉(zhuǎn)導中起著重要作用，信號通路中最常見的過程便是蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化。因此，定義復雜的信號通路需要定量的、實驗性的、蛋白質(zhì)組學的動力學數(shù)據(jù)。研究者們試圖通過WB對數(shù)學模型和蛋白質(zhì)表達動力學的結果進行比較，來模擬和預測蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡。然而，每次WB實驗可以檢測的樣本數(shù)量和蛋白種類是不多的。為了驗證數(shù)學模型的有效性，信號轉(zhuǎn)導中的蛋白水平應該被描述為時間或其他變量的函數(shù)。與WB和單細胞技術相反，只要有合適的抗體，RPPA就可以檢測大量樣本中的多種蛋白質(zhì)，包括磷酸化蛋白質(zhì)。 Ramalingam等(2007)使用RPPA技術研究了p53-Mdm2反饋回路的數(shù)學模型。如下圖所示。
07、抗癌藥物靶標分子 大多數(shù)抗癌藥物的作用機制尚不清楚。這在很大程度上是由于缺乏適當?shù)目梢员O(jiān)測藥物應答的分子調(diào)控網(wǎng)絡詳細信息的模型和方法。
基于RPPA技術，已經(jīng)有很多學者通過信號通路相關的抗體來分析腫瘤，并可擴展到其他任何細胞類型，對其中的目標蛋白進行檢測。以往是通過常規(guī)WB或免疫組織化學方法對信號通路蛋白進行研究，而RPPA技術與這些方法相比較而言有以下幾個優(yōu)勢：(1)每次實驗僅需微量樣本，(2)定量數(shù)據(jù)結果，(3)樣本間嚴謹?shù)膶φ眨?4)多重蛋白檢測能力。除此之外，很多學者已經(jīng)使用了大量的腫瘤樣本、臨床樣本或細胞系對通路蛋白進行了詳細的研究。Paweletz等人(2001)首次通過RPPA技術描述了前列腺上皮細胞中的癌癥進展，Akt信號通路激活(磷酸化的結果)抑制了細胞凋亡過程。Rudelius等人(2006)提示套細胞淋巴瘤中的 Akt活化可能是由于PTEN表達缺失所致，PI3K/Akt抑制劑可能是治療套細胞淋巴瘤的有效藥物。在過去的幾年里，RPPA技術促進了研究研究人員對于癌癥相關的信號通路中的蛋白質(zhì)的研究。盡管由于異質(zhì)性、蛋白穩(wěn)定性和樣本數(shù)量等問題導致腫瘤組織的分子靶向研究非常困難，但是對于患者樣本中的真實信息的研究從未停止。RPPA技術允許每次實驗僅使用少量體積的樣本就可以進行大量樣本的全面的多維蛋白質(zhì)組學分析。基于對信號通路的了解，我們相信機體對于抗癌藥物的應答絕不僅僅是一個分子的狀態(tài)發(fā)生了改變。盡管抗癌藥物是基于已經(jīng)確定了分子靶點，但仍不清楚為什么會出現(xiàn)副作用、二次效應(如細胞周期停滯或細胞凋亡))，多少濃度的藥物實際被傳遞(或當給藥多種藥物時，濃度的協(xié)同效應)。在實際中，如果沒有合適的體外模型的話，很難推測患者的腫瘤中到底發(fā)生了什么。RPPA的優(yōu)勢在于通過這種堅實的理論方法可以提供丟失的信息。 08、結論 很明顯，反相蛋白微陣列技術為我們提供了獨特的機會從功能水平上理解癌癥生物學。然而，蛋白質(zhì)的生化狀態(tài)取決于很多因素。通過詳細監(jiān)測和了解經(jīng)過藥物治療的癌細胞內(nèi)的分子相互作用，可以理解清楚一些重要問題，例如，為什么有些藥物可以發(fā)揮作用而其他藥物就不能。具有高通量和定量特性的反相蛋白微陣列技術將成為癌癥研究的強有力的工具。雖然反相蛋白質(zhì)陣列技術開展的要求比較高，但可以有效且高效的開展多維研究。雖然蛋白質(zhì)組學分析為癌癥研究提供了新的視角，但提出了技術上的挑戰(zhàn)。最終，反相蛋白微陣列技術在癌癥研究中的成功應用是跨學科匯集的結果，包括工程學、化學、數(shù)學、統(tǒng)計學、計算科學、生物學和醫(yī)學。 參考資料： Spurrier，2008. Protein and lysate array technologiesin cancer research，Biotechnology Advances 26:361–369. https://www./home-research-index-rid-56999.shtml http://www.sohu.com/a/342762711_777125
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