9.熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

一、什么是熒光素酶和雙熒光素酶？

熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)是以熒光素（luciferin）為底物來檢測(cè)螢火蟲熒光素酶（Firefly Luciferase）活性的一種報(bào)告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會(huì)發(fā)出生物熒光（bioluminescence），可通過熒光測(cè)定儀設(shè)備測(cè)定luciferin氧化過程中釋放的生物熒光，常應(yīng)用于miRNA靶基因驗(yàn)證及啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控等方向研究。

利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的特性，把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因的上/下游，構(gòu)建成熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，適當(dāng)刺激或處理后裂解細(xì)胞，測(cè)定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對(duì)感興趣的調(diào)控元件的影響。

雙熒光素酶通常是指螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶。螢火蟲熒光素酶是從甲蟲（Photinus pyralis）中分離得到，分子量為61kDa；海腎熒光素酶（Renilla Luciferase）則是從海腎（Renilla reniformis）中分離，分子量為36kDa。

（一）兩種酶的區(qū)別？

1. 底物和輔因子不同：螢火蟲熒光素酶需要熒光素、氧氣、ATP和鎂離子同時(shí)存在才能發(fā)光；而海腎熒光素酶僅需要腔腸素（coelenterazine）和氧氣。

2. 發(fā)光的顏色不同：螢火蟲熒光素酶產(chǎn)生的光顏色呈現(xiàn)黃綠色，波長(zhǎng)550-570nm；而海腎熒光素酶產(chǎn)生藍(lán)光，波長(zhǎng)480nm。正是由于這兩種酶的底物和發(fā)光顏色不同，所以在雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用。

（二）為什么采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)？

單報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)往往會(huì)受到各種實(shí)驗(yàn)條件的影響，而雙報(bào)告基因則通過共轉(zhuǎn)染的“對(duì)照”作為內(nèi)參為試驗(yàn)提供一基準(zhǔn)線，從而可以在最大程度上減小細(xì)胞活性和轉(zhuǎn)染效率等外在因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，使得數(shù)據(jù)結(jié)果更為可信。一般情況下，海腎熒光素酶基因作為內(nèi)參使用，將帶有海腎熒光素酶基因的質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞；或是將兩個(gè)報(bào)告基因構(gòu)建到同一個(gè)質(zhì)粒上，分別用不同的啟動(dòng)子啟動(dòng)其表達(dá)。計(jì)算結(jié)果時(shí)，將螢火蟲熒光素酶的檢測(cè)值比上海腎熒光素酶檢測(cè)值（Firefly Luciferase/ Renilla Luciferase），這樣就可以減少內(nèi)在變化因素對(duì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的影響，相當(dāng)于做了標(biāo)準(zhǔn)化，使測(cè)試結(jié)果不受實(shí)驗(yàn)條件變化的干擾。

（三）雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)有哪些常用的載體？

1. 兩種熒光素酶分別位于兩個(gè)載體上。

比如研究miRNA的靶基因?qū)嶒?yàn)時(shí)，這兩種載體分別為：

（1）pMIR-REPORT載體：它用來插入miRNA靶序列，評(píng)估細(xì)胞內(nèi)miRNA功能。該載體包含一個(gè)CMV啟動(dòng)子控制下的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因。在熒光素酶基因的3'UTR區(qū)域包含一個(gè)多克隆位點(diǎn)，用于插入預(yù)測(cè)miRNA的結(jié)合靶序列或其他核苷酸序列。若熒光素酶活性下降，說明該段插入序列受到miRNA調(diào)節(jié)，這模仿了miRNA靶序列的作用方式。

（2）pRL系列載體（以pRL-CMV為例），pRL系列載體可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中組成型地表達(dá)海腎熒光素酶。

又如，研究轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子的實(shí)驗(yàn)時(shí)，兩種載體分別為：

（1）pGL4.20載體，pGL4.20載體含Luciferase熒光素酶報(bào)告基因，無啟動(dòng)子，用于研究目的啟動(dòng)子的功能，在熒光素酶基因的上游包含一個(gè)多克隆位點(diǎn)，用于插入啟動(dòng)子序列，若Luciferase熒光素酶活性上升，說明該段啟動(dòng)子受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。

（2）pRL系列載體。

2. 兩種熒光素酶位于同一個(gè)載體上。這樣偏差更小，畢竟轉(zhuǎn)染一個(gè)質(zhì)粒比轉(zhuǎn)染兩個(gè)質(zhì)粒要容易，在這方面，根據(jù)檢索到的資料顯示，現(xiàn)在的這類質(zhì)粒比較有名的是Promega公司的pmirGLO質(zhì)粒。

二、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)有哪些應(yīng)用？

（一）驗(yàn)證microRNA同某基因mRNA靶向互作。將待測(cè)mRNA的3’UTR序列插入報(bào)告基因載體，再共轉(zhuǎn)入該microRNA，如果螢光素酶活性下降，則提示為其靶序列。

（二）驗(yàn)證microRNA同lncRNA靶向互作。將候選的lncRNA序列插入報(bào)告基因載體中F-Luc的3’UTR區(qū)域，檢測(cè)螢光素酶活性。

（三）驗(yàn)證特定轉(zhuǎn)錄因子同其調(diào)控序列的作用。將該序列（通常為啟動(dòng)子區(qū)域）插入報(bào)告基因載體，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中共轉(zhuǎn)過表達(dá)該轉(zhuǎn)錄因子，可分析轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)是否提高螢光素酶活性。

（四）啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)分析。將啟動(dòng)子區(qū)域序列（通常2k左右）進(jìn)行分段截短，或?qū)μ囟ㄎ稽c(diǎn)進(jìn)行突變，再分別構(gòu)建入luciferase報(bào)告載體，檢測(cè)其啟動(dòng)子活性。

（五）啟動(dòng)子SNP分析。一些基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在單核苷酸多態(tài)性，可運(yùn)用螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析其相對(duì)活性。

（六）可以分析信號(hào)通路是否激活。將該信號(hào)通路的下游響應(yīng)原件序列構(gòu)建入報(bào)告基因載體，在不同上游信號(hào)條件下，螢光素酶活性代表了通路的下游響應(yīng)。如將HIF1α的響應(yīng)原件hypoxia-responsive?element?(HRE)插入luciferase報(bào)告載體構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，可以用于低氧相關(guān)通路的研究。又如，在GPCR研究中，將cAMP?response?element（CRE）載入報(bào)告基因載體，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株后，可以用于分析GPCR的激活與抑制劑篩選。

三、實(shí)驗(yàn)步驟（以驗(yàn)證Gene A為miRNA的靶基因?yàn)槔?/span>

主要分為：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞→雙報(bào)告基因檢測(cè)→統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.需要的病毒或者質(zhì)粒：

miRNA-Ctrl/miRNA-OE（miRNA的ctrl和OE可以提前包好病毒）

pMIR-REPORT（不插入任何片段，作為control）

pMIR-REPORT-WT（將Gene A的3’UTR插入pMIR-REPORT）

pMIR-REPORT-MT（將Gene A的3’UTR突變后插入pMIR-REPORT）

pMIR-REPORT-miRNA^pos（將miRNA的反向互補(bǔ)序列插入，作為陽(yáng)性對(duì)照）

pRL-CMV（作為內(nèi)參）

（根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要也可以再設(shè)置siRNA組）

2.實(shí)驗(yàn)步驟（以24孔板為例）

· Day1 種細(xì)胞于24孔板

· Day2 病毒感染（根據(jù)實(shí)驗(yàn)加入一定量的miRNA-Ctrl/miRNA-OE）

· Day3 Report質(zhì)粒轉(zhuǎn)染（以24孔板一個(gè)孔為例，實(shí)驗(yàn)時(shí)可配置成Mix逐孔加入以減少誤差）:

25ul opti-MEM+300ng plasmid+10ng pRL-CMV

25ul opti-MEM+0.45ul lip2000

6h后換液

（實(shí)驗(yàn)分組可參考下圖，每個(gè)組可以設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔）

· Day4 雙報(bào)告基因檢測(cè)

（1）1 X cold PBS清洗一遍，加入80-100ul lysis buffer（buffer用量可以根據(jù)細(xì)胞量進(jìn)行調(diào)整）；

（2）在搖床上冰上被動(dòng)裂解30min；

（3）4℃，12000rpm離心10min；

（4）吸取上清10ul于luciferase 專用96孔板；

（5）依次加入50ul Firefly Luciferase Buffer(FB)或50ul Renilla Luciferase Buffer(RB)（RB中加入腔腸素，現(xiàn)用現(xiàn)加,FB和RB可在441室再加入）;

（6）酶標(biāo)儀檢測(cè)發(fā)光。

四、數(shù)據(jù)分析（以miRNA調(diào)控靶基因的實(shí)驗(yàn)為例）

1.先計(jì)算出每孔的Firefly?Luciferase/?Renilla?Luciferase?的比值(F/R，第4列和第10列)；

2.求出miRNA-Ctrl三個(gè)重復(fù)孔的平均值（下圖第5列 average1）；

3.再以miRNA-Ctrl組的average1為標(biāo)準(zhǔn)1，用miRNA-OE組的F/R三個(gè)重復(fù)值（第10列）分別除以average1 得到三個(gè)ratio(相當(dāng)于進(jìn)行了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化);

4.求出ratio的平均值作為average2。

5.分別用average1和average2的值作柱狀圖。

五、常見問題分析

正是由于報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果受多種因素影響，如載體狀態(tài)、細(xì)胞狀態(tài)、轉(zhuǎn)染量、轉(zhuǎn)染效率、裂解效率、加樣精度、檢測(cè)過程等，一旦某個(gè)細(xì)節(jié)處理不好，都可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或結(jié)果的不準(zhǔn)確。

（一）熒光值過高

熒光值過高可通過以下方式嘗試解決：

1. 減少質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量；

2. 細(xì)胞樣品裂解后，離心取上清后可適當(dāng)稀釋后檢測(cè)。

注：不建議通過減少底物量來降低熒光值，需要保證底物的飽和來反映熒光素酶真實(shí)的表達(dá)水平，否則會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)大的偏差。

（二）熒光值過低

若檢測(cè)到的熒光值比較低或無熒光值，可從樣品裂解效率、轉(zhuǎn)染效率、檢測(cè)過程等這幾方面進(jìn)行考慮：

1. 轉(zhuǎn)染效率低

（1）優(yōu)化轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)條件； 

（2）確保轉(zhuǎn)染DNA的質(zhì)量，可通過酶切或瓊脂糖凝膠電泳的方法對(duì)DNA質(zhì)量進(jìn)行鑒定；

（3）選擇活性較高，處于指數(shù)分裂期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2.檢測(cè)過程操作不規(guī)范

（1） 需加入足量底物，保證底物的飽和，否則會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)很大偏差；

（2）室溫反應(yīng)。反應(yīng)時(shí)各個(gè)組分（細(xì)胞裂解產(chǎn)物，底物工作液等）都需要調(diào)整到室溫；

（3）熒光素酶的半衰期一般約30min，加完底物后可立即檢測(cè)，盡量在30 min內(nèi)完成。

3.底物氧化失效

（1）底物避光密封保存，螢火蟲熒光素酶底物-20℃保存；海腎熒光素酶底物推薦-80℃保存；

（2）反應(yīng)工作液建議現(xiàn)用現(xiàn)配。

（三）復(fù)孔重復(fù)性差

報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)受多種因素影響，因此同批次樣品檢測(cè)值也可能出現(xiàn)浮動(dòng)。除了引入另一個(gè)報(bào)告基因作為內(nèi)參照避免實(shí)驗(yàn)條件變化的干擾之外，一般還需設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。想要得到一個(gè)準(zhǔn)確的結(jié)果，應(yīng)盡可能減小復(fù)孔之間的差異性：

1. 細(xì)胞裂解后建議離心取上清，保證樣本的均一性；

2. 保證加樣的準(zhǔn)確性，移液器需定期校準(zhǔn)，確保移液精準(zhǔn)；

注：熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的檢測(cè)結(jié)果非常靈敏，復(fù)孔之間的數(shù)值有一定差異是正常的，一般認(rèn)為在同一個(gè)數(shù)量級(jí)的差異是可以接受的。

六、熒光素酶報(bào)告基因還有哪些其他用法？

熒光素酶基因還可以用來標(biāo)記細(xì)胞和活體動(dòng)物，步驟如下：

· 將熒光素酶基因插到預(yù)期分析的細(xì)胞染色體內(nèi)；

· 通過單克隆細(xì)胞技術(shù)的篩選，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株，當(dāng)細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)移、分化時(shí), 熒光素酶也會(huì)得到持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)；

· 將標(biāo)記好的細(xì)胞接種到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)后，當(dāng)外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP，氧存在的條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，因此只有在活細(xì)胞內(nèi)才會(huì)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且發(fā)光光強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)。

 熒光素酶報(bào)告基因標(biāo)記活體動(dòng)物的應(yīng)用領(lǐng)域：

（1）腫瘤學(xué)：熒光素酶報(bào)告基因活體成像能夠讓研究人員能夠直接快速的測(cè)量各種癌癥模型中腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移以及對(duì)藥物的反應(yīng)。非常適合于腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)的定量分析，避免宰殺老鼠。

（2）干細(xì)胞與免疫學(xué)：螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因做示蹤標(biāo)記干細(xì)胞，將目的基因與螢火蟲熒光素酶基因融合融合表達(dá)，做成轉(zhuǎn)基因小鼠，進(jìn)行干細(xì)胞移植，可以用活體生物發(fā)光成像技術(shù)示蹤干細(xì)胞在體內(nèi)的增殖、分化及遷徙的過程。

可以通過標(biāo)記免疫細(xì)胞，觀察免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞等的識(shí)別和殺死功能，評(píng)價(jià)免疫細(xì)胞的免疫特異性、增殖、遷移及功能等。

（3）蛋白質(zhì)相互作用：可利用動(dòng)物體內(nèi)生物發(fā)光成像技術(shù)研究活體動(dòng)物體內(nèi)蛋白與蛋白的相互作用。其原理是將分開時(shí)都不單獨(dú)發(fā)光的熒光酶的C端和N端分別連接在兩個(gè)不同的蛋白質(zhì)上，若是這兩個(gè)蛋白質(zhì)之間有相互作用，熒光酶的C端和N端就會(huì)被連接到一起，激活熒光素酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在有底物存在時(shí)出現(xiàn)生物發(fā)光。在活體條件下研究藥物對(duì)蛋白質(zhì)相互作用的影響，可以觀察到在體外實(shí)驗(yàn)中無法模擬的活體環(huán)境對(duì)蛋白質(zhì)相互作用的影響。（熒光素酶酶活恢復(fù)法檢測(cè)體內(nèi)蛋白質(zhì)互作，來自螢火蟲的熒光素酶（Firefly luciferase, LUC）可以分成N和C兩段蛋白質(zhì)而沒有酶活，將N和C端各融合另外的兩個(gè)蛋白質(zhì)，如果這兩個(gè)蛋白質(zhì)在體內(nèi)可以互作的話，那么LUC的N和C端將在空間上靠近而恢復(fù)酶活，因此可以通過檢測(cè)分段的LUC可否恢復(fù)酶活而判斷兩個(gè)蛋白質(zhì)之間在體內(nèi)是否存在相互作用。）

附件：9.熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn).docx