【原】細胞遷移 VS 侵襲大不同！想要劃痕和 Transwell 實驗的實操？包會的！ | MedChemExpress (MCE)

在科學研究中，細胞遷移和侵襲是理解生物體內許多重要過程的關鍵。本期文章深入探討了常用的檢測方法：細胞劃痕實驗和 Transwell 遷移/侵襲實驗。一起來看下吧~


我的"寶貝"細胞終于養好了，導兒說做遷移和侵襲試試，一頭霧水.....

莫慌，遷移和侵襲可是大有不同！小 M 整理的這篇“干貨”涵蓋了基礎講解，實驗操作，以及常見問題解答，包會的！

01
遷移VS侵襲,大不同！

細胞遷移

細胞遷移 (又稱“細胞爬行、細胞移動或細胞運動”) 是細胞在接收到遷移信號或感受到其他物質的梯度后而產生的移動。細胞伸出頭部偽足并建立新的黏附，通過收縮細胞體尾部在時空上交替的過程。

遷移是活細胞普遍存在的一種運動形式，胚胎發育、傷口愈合、免疫應答、組織重塑等重要生命活動過程都涉及細胞遷移^[1][2]。

圖 1. 細胞遷移的示意圖^[3]。 

細胞侵襲

細胞侵襲是入侵的細胞 (如癌細胞) 分泌蛋白酶降解胞外基質層 (ECM) 或基底膜基質層 (BME)，穿透基質或組織進入血管和淋巴管，從一個區域侵入到另一個區域的過程。

侵襲常發生于癌細胞轉移等過程中，是細胞遷移的一種特殊形式^[2]。

  Tips：

• 侵襲是腫瘤細胞及其微環境發生多種變化的累積結果，這些變化使細胞能夠遷移并侵入健康的宿主組織。

• 當增殖的腫瘤細胞試圖逃離原發腫瘤部位時，必須發生局部細胞粘附和周圍組織的侵襲。在穿透血管內皮并進入血流之前，癌細胞必須通過降解胞外基質層 (ECM) 蛋白質成分侵入局部組織，并最終穿過基底膜。一旦進入血液循環，這些細胞就可以在次要位置形成轉移性集落。

細胞遷移和侵襲都是細胞在環境中移動，依賴于細胞骨架的重組和細胞膜的動態變化，且受到細胞外信號 (如趨化因子、細胞因子等) 調控，與 ECM 的相互作用密切相關。但二者在機制、功能和意義方面有所區別。

02
細胞遷移檢測

細胞遷移實驗可以揭示遷移機制，用于藥物篩選與評估。廣泛應用于癌癥研究、傷口愈合、免疫學、發育生物學等多個領域。

細胞劃痕實驗和 Transwell 遷移實驗是檢測細胞遷移能力最常見的方法。

細胞劃痕實驗

  一、細胞劃痕實驗

細胞劃痕實驗，又稱“傷口愈合實驗”，是一種經典的檢測細胞遷移運動與修復能力的方法。

• 原理：在體外培養皿或平板培養的單層貼壁細胞上，用槍頭或其它硬物在細胞生長的中央區域劃線，去除中央部分的細胞，然后繼續培養細胞至實驗設定的時間，依據劃痕邊緣細胞逐漸進入空白區域使“劃痕”愈合的能力，判斷細胞生長遷移能力^[5]。其可模擬傷口愈合過程，用于評估細胞在傷口處的遷移能力。

實驗材料

實驗前準備：細胞、培養基、Transwell 小室或培養皿、劃痕工具 (無菌移液槍尖、劃痕刮刀或細胞劃痕器)、顯微鏡、合適的染色試劑 (如結晶紫或 DAPI)。

實驗步驟

(1) 細胞培養：將細胞以適宜的密度接種到培養皿或小室中進行培養，直到細胞生長到 80%-90% 匯合狀態。
(2) 劃痕制備：使用無菌移液槍頭或劃痕器在細胞單層上輕輕劃出一道直線或網格狀傷口，確保可以形成均勻的劃痕。在劃痕處，盡量避免損傷周圍細胞，以減少對數據的干擾。
(3) 清洗細胞：輕輕用 PBS 沖洗細胞兩次，以去除游離的、未附著的細胞。
(4) 更換培養基：更換新鮮的培養基，保持實驗條件的一致性。
(5) 觀察劃痕愈合：用顯微鏡拍攝劃痕的圖像，記錄初始劃痕的狀態 (T0)，隨后在 0、12、24、48 小時等不同時間點拍照，觀察劃痕的寬度或遷移的細胞數。

(6) 數據分析：使用圖像分析軟件 (如 ImageJ) 分析拍攝的圖像，測量劃痕的寬度，計算愈合面積。

注意事項

• 劃痕：劃痕時確保寬度一致，形狀盡量規則。

• 對照組：設置適當的對照組 (如未處理組) 以便比對實驗結果。

• 顯微鏡觀察：定期拍照記錄，確保拍攝角度一致，以便于后期比較。

Transwell 遷移實驗

  二、Transwell 遷移實驗

Transwell 遷移實驗，又稱“穿孔實驗”，是一種廣泛使用的細胞遷移實驗技術。

• 原理：將小室放入培養板中，小室內稱為上室，培養板內稱為下室，上下層培養液以聚碳酸酯膜相隔，上室內添加上層培養液，下室內添加下層培養液。將細胞種在上室內，由于膜有通透性，下層培養液中的成分可以影響到上室內的細胞，從而可以研究下層培養液中的成分對細胞生長、運動等的影響^[9]。

圖 4. Transwell 遷移檢測的示意圖^[9]。 

實驗材料

實驗前準備：Transwell 小室 (通常為 8 μm 的孔徑)、細胞、培養基、化學趨化因子、PBS、甲醇或 4% 多聚甲醛、染色試劑 (如結晶紫、DAPI 或吉姆薩染色)、移液器和槍頭、顯微鏡。

實驗步驟

(1) 細胞培養：將細胞以適宜濃度接種于 Transwell 的上室中培養，直到細胞生長到 70%-80% 匯合。
(2) 準備下室：在下室中加入合適濃度的化學趨化因子 (如生長因子、細胞因子) 和培養基，建立化學梯度。
(3) 實驗設置：可以設置對照組 (無趨化因子) 與實驗組 (有趨化因子) 以比較細胞遷移能力的變化。
(4) 遷移實驗：將 Transwell 小室置于培養箱中，一般孵育 24-48 小時，具體時間視細胞系和實驗目的而定，以促使細胞向下室遷移。
(5) 清洗細胞：用 PBS 輕輕沖洗 Transwell 上室，以去除未遷移的細胞。沖洗通常進行 2-3 次，減少背景噪聲。
(6) 固定細胞：用甲醇或 4% 多聚甲醛固定細胞，常見的固定時間為 10-15 分鐘。固定結束后，用 PBS 沖洗細胞兩次，去除多余的固定液。
(7) 染色細胞：將染色劑 (如 0.1% 的結晶紫溶液) 加入 Transwell 的上室染色 20-30 分鐘。染色后，用 PBS 輕輕沖洗 2-3 次，以去除多余的染料。
(8) 觀察與計數：使用顯微鏡觀察 Transwell 膜，然后拍攝圖像。選擇隨機區域計數遷移到膜底部的細胞。根據各組遷移的細胞數量進行比較，統計并計算遷移率。

圖 5. 人間充質干細胞通過 Transwell 小室遷移^[8]。

注意事項

• Transwell 系統：選擇合適的透膜孔徑 (通常 8 或 12 μm) 或膜材料。

• 細胞狀態：確保細胞在對數生長期，以確?；盍Ω哌m合遷移。

• 操作輕柔：在沖洗和固定細胞時，操作應輕柔，以避免損傷已遷移的細胞。時間選擇：不同細胞系的遷移能力不同，因此需根據具體細胞的特性調整實驗時間。

02細胞侵襲檢測

細胞侵襲實驗可用于研究細胞穿透基質或組織的能力，細胞侵襲性、揭示侵襲機制、藥物篩選與評估，癌細胞轉移能力及細胞對環境變化的反應。廣泛應用于癌癥、創傷修復、免疫反應和再生醫學等多個領域。
Transwell 侵襲實驗是檢測細胞侵襲能力最常見的方法。

Transwell 侵襲實驗

  三、Transwell 侵襲實驗

Transwell 侵襲實驗是一種廣泛用于評估細胞 (如腫瘤細胞) 侵襲能力的體外技術。

• 原理：與 Transwell 遷移實驗類似，但不同的是，聚碳酸酯膜的上表面需涂布一層類似基質的材料 (如 Matrigel 或膠原蛋白) 以模擬細胞外基質的環境，細胞會分泌酶類 (如基質金屬蛋白酶, MMPs) 以降解基質膠才能進入下室，計數進入下室的細胞即可反映細胞的侵襲能力^[10]。該實驗可了解細胞侵襲的調控機制，為相關疾病的治療提供依據。

實驗材料

實驗前準備：Transwell 小室 (通常 5 或 8 μm 孔徑)、基質膠 (如 Matrigel 或膠原蛋白)、細胞系、培養基、化學趨化因子、PBS、甲醇或 4% 多聚甲醛、染色試劑 (如結晶紫、DAPI 或吉姆薩染色)、移液器和槍頭、顯微鏡。 

實驗步驟

(1) 細胞培養：將細胞以適宜濃度接種培養皿中，確保細胞生長至 70%-80% 匯合。

(2) 準備基質膠：根據廠家的說明書，在冰上將所需量的基質膠 (Matrigel 或膠原蛋白) 溶解。在 Transwell 上室底部涂抹必要厚度的基質膠 (通常為 50-100 μL)。在 4℃ 下孵育約 30 分鐘- 1 小時，以確?；|膠固化。

(3) 準備下室：在 Transwell 下室中加入合適濃度的化學趨化因子 (如生長因子、細胞因子) 和培養基。

(4) 遷移實驗：將細胞 (通常為 1-2×10⁵ 個細胞) 懸浮于適宜的培養基中，并添加到 Transwell 上室中。在培養箱中孵育 24-48 小時，具體時間視細胞系和實驗目的而定，細胞則向下室遷移和侵襲。

(5) 清洗細胞：用 PBS 輕輕沖洗 Transwell 上室，去除未侵襲的細胞。沖洗通常進行 2-3 次，減少背景噪聲。

(6) 固定細胞：用甲醇或 4% 多聚甲醛在 Transwell 上室中固定細胞，固定時間 10-15 分鐘。固定結束后，用 PBS 沖洗細胞 2 次，去除多余的固定液。

(7) 染色細胞：將染色劑 (如 0.1% 結晶紫溶液) 加入 Transwell 上室染色 20-30 分鐘。用 PBS 輕輕沖洗 2-3 次，去除多余的染料。

(8) 觀察與計數：使用顯微鏡觀察 Transwell 膜，拍攝圖像。并選擇隨機區域計數侵襲到膜底部的細胞。根據各組侵襲的細胞數量進行比較，統計并計算侵襲率。

圖 7. Transwell 侵襲實驗中 Rac1 siRNA 抑制 SNB19 細胞通過 Matrigel 的侵襲^[11]。 

注意事項

• 基質膠的處理：基質膠需在冰上處理，以保持其生物活性；鋪膠時，盡量垂直小室底部在小室底部中間加入，避免產生氣泡。

• 細胞狀態：確保細胞在對數生長期，以確保活力高適合侵襲。

• 輕柔操作：在沖洗和固定細胞時，操作應輕柔，避免損傷已侵襲的細胞。

• 觀察時間選擇：不同細胞系的侵襲能力不同，根據具體細胞的特性和對實驗的預期效果調整實驗時間。

03
常見問題及解答

? 為何實驗中細胞遷移不足？

答：可能的原因包括細胞狀態不處于健康生長期、培養條件不具有適宜的培養基和生長因子、基質的厚度和成分不適合研究細胞遷移、實驗環境不利于細胞遷移、孵育時間不充分等。
?  為什么細胞在 Transwell 實驗中不能通過基質？
答：可能的原因包括選擇的膜孔徑偏小、基質膠或 Matrigel 的濃度過高、產生氣泡、缺少促進細胞侵襲的生長因子或細胞因子、細胞傳代次數太多失去遷移活性、細胞系不適合等。
? 實驗過程中如何減少背景噪聲？
答：實驗后使用PBS徹底沖洗、使用適當濃度的染料并控制染色時間、在固定和沖洗細胞時避免損傷細胞等。
? 如何選擇合適的細胞系進行遷移和侵襲實驗？

? 染色后細胞分布不均一可能原因？
答：Transwell 小室未平衡放置于孔板中、細胞懸液未混勻、小室發生傾斜或晃動、小室的滲透膜不平等。
? Transwell 小室接種細胞的加液順序是什么？
答：先將完全培養基加入培養皿或孔板中 (下室)，再輕輕將小室放入下室中。在放入時，建議將小室稍稍傾斜，一側先接觸液面，避免垂直放入產生氣泡。之后將混合均勻的細胞懸液加入小室內部。

 參考文獻：
[1] Vicente-Manzanares M, et al. Cell migration: an overview. Methods Mol Biol. 2011;769:1-24. 

[2] Sahai E. Mechanisms of cancer cell invasion. Curr Opin Genet Dev. 2005 Feb;15(1):87-96. 
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[5] Liang CC, et al. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2007;2(2):329-33.
[6] Hulkower KI, et al. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 2011 Mar 11;3(1):107-24. 
[7] Pijuan J, et al. In vitro Cell Migration, Invasion, and Adhesion Assays: From Cell Imaging to Data Analysis. Front Cell Dev Biol. 2019 Jun 14;7:107.
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[9] Justus CR, et al. Transwell In Vitro Cell Migration and Invasion Assays. Methods Mol Biol. 2023;2644:349-359.
[10] Shaw L M. Tumor cell invasion assays[J]. Cell migration: developmental methods and protocols, 2005: 97-105.
[11] Valster A, et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 2005 Oct;37(2):208-15.