氫氣降低老年性癡呆動物毒性代謝物和氧化應激

阿爾茨海默?。ˋD）是一種神經退行性疾病，其中β-淀粉樣蛋白（Aβ）斑塊會引發氧化應激（OS）和神經炎癥，導致記憶喪失。反應性星形膠質細胞也可能引發氧化應激和神經退行性變，通過星形膠質細胞尿素循環中有毒代謝物的積累促進阿爾茨海默病的發展。然而，分子氫（H?）對該循環的影響尚不明確。因此，我們研究了氫氣治療是否能減輕氧化應激誘導的神經退行性變和記憶喪失。將5xFAD小鼠（n=14）和野生型小鼠（n=15）隨機分為四組，分別用3%氫氣（H?）或溶媒處理60天。采用Morris水迷宮和Y迷宮實驗評估小鼠的認知行為。此外，我們通過生化檢測測量小鼠海馬體和經AβO處理的原代小鼠星形膠質細胞中氨和過氧化氫（H?O?）的水平。利用免疫組織化學（IHC）和實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）評估Aβ、γ-氨基丁酸（GABA）以及炎癥標志物的表達。我們發現，氫氣處理顯著改善了5xFAD小鼠的認知缺陷、氧化應激、有毒代謝物積累以及炎癥標志物升高的情況。這些結果表明，氫氣療法可減輕星形膠質細胞尿素循環中的有毒代謝物，從而減少阿爾茨海默病中的神經退行性變和記憶喪失。

1. 引言

記憶障礙和神經退行性變是阿爾茨海默病（AD）的病理生理學特征，該病主要發生在65歲及以上人群中，構成了嚴重的公共衛生負擔。在阿爾茨海默病中，β-淀粉樣蛋白（Aβ）斑塊（即不溶性Aβ纖維和 tau 纏結的大量沉積）在大腦中積累時，會引發氧化應激（OS）、炎癥和細胞凋亡，因此它們是阿爾茨海默病發病機制的關鍵標志物[1,2,3]。氧化應激與神經退行性疾?。òò柎暮Ｄ　⑴两鹕『洼p度認知障礙）的發病有關。它會破壞神經元脂質膜，導致與DNA損傷相關的細胞死亡，并通過蛋白質氧化機制進一步刺激Aβ的積累[4]。這些作用會造成神經元損傷，最終導致阿爾茨海默病相關的記憶喪失[5]和線粒體功能障礙[6,7,8]，并導致細胞色素氧化酶活性缺陷和鈣（Ca2?）信號改變[9,10,11]。同樣，促凋亡標志物Bax可激活線粒體中的半胱天冬酶（如半胱天冬酶-3、-8和-9），通過凋亡促進神經退行性變[7]。氧化應激可通過核因子κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）樞紐觸發神經炎癥，導致神經退行性變和阿爾茨海默病的發生[12]。

反應性星形膠質細胞也可能導致神經退行性變和記憶喪失[13]。隨著氧化應激和亞硝化應激的增加，星形膠質細胞成為“雙刃劍”，既具有神經保護作用，又會產生神經毒性[14]。這種神經毒性源于有毒代謝物的積累增加，從而增強了星形膠質細胞的反應性。氨等有毒代謝物會激活星形膠質細胞尿素循環，并觸發腐胺、過氧化氫（H?O?）和γ-氨基丁酸（GABA）的合成[15,16]。在阿爾茨海默病中，細胞內積累的β-淀粉樣蛋白（Aβ）可通過自噬-溶酶體途徑清除，釋放出天冬氨酸等氨基酸，這些氨基酸進入星形膠質細胞尿素循環，在精氨琥珀酸合成酶1的作用下轉化為精氨琥珀酸。然后，在精氨琥珀酸裂解酶的催化作用下，精氨琥珀酸轉化為精氨酸。精氨酸酶1（ARG1）將精氨酸轉化為鳥氨酸，尿素作為廢物釋放。鳥氨酸在鳥氨酸脫羧酶1（ODC1）的作用下發生脫羧反應生成腐胺，腐胺經過一系列酶促轉化，產生過氧化氫和氨作為副產物，最終生成γ-氨基丁酸。產生的氨與谷氨酸發生N-乙?；磻纬砂被柞Ａ姿帷Ｈ缓螅B氨酸轉氨甲酰酶（OTC）將氨基甲酰磷酸轉化為瓜氨酸。瓜氨酸也可轉化為精氨琥珀酸，從而使循環重復進行[13,17,18]。過氧化氫作為一種關鍵的活性氧（ROS），γ-氨基丁酸則分別促成神經退行性變和記憶障礙[18]。負責產生這些有毒代謝物的關鍵酶是精氨酸酶1、鳥氨酸脫羧酶1和鳥氨酸轉氨甲酰酶[19]。

Ju等人闡明了反應性星形膠質細胞雙重功能背后的分子機制，包括有益的尿素循環活性通路（可解毒Aβ分解代謝物）和有害的循環（會增加鳥氨酸脫羧酶1的表達，從而促進有毒的過氧化氫、氨和γ-氨基丁酸的積累）[18]。星形膠質細胞反應性增強可導致膠質纖維酸性蛋白（GFAP）水平過表達。膠質纖維酸性蛋白作為一種新興的阿爾茨海默病診斷標志物，其過表達標志著星形膠質細胞死亡（也稱為星形膠質細胞增生）[16]。

盡管對阿爾茨海默病的病理生理學進行了廣泛研究，但目前尚無治愈方法[20]。膽堿酯酶抑制劑[21]、美金剛、侖卡奈單抗和多奈單抗等治療方法只能延緩阿爾茨海默病的進展[22,23]。近年來，分子氫（H?）在多種疾?。òㄉ窠浲诵行约膊。┲酗@示出療效[17,24,25,26]。氫氣能有效減輕氧化應激、炎癥和細胞凋亡[27,28,29]。氫氣分子體積小，易于穿透細胞膜并穿過血腦屏障，對中樞神經系統產生作用[17,24,25,26]。在包括阿爾茨海默病在內的神經退行性疾病中，氫氣療法已被證明可通過選擇性減少活性氧以及調節炎癥和凋亡信號通路來減輕氧化應激[27,30]。具體而言，富氫水與抑制NLRP3炎癥小體有關，NLRP3炎癥小體是先天免疫反應的重要組成部分，已被證實與阿爾茨海默病相關[31]。此外，氫氣療法已被證明可調節腦源性神經營養因子和雌激素受體β，這兩種物質對突觸可塑性和神經元存活至關重要[32]。此外，在化學誘導的輕度認知障礙模型中，有報道稱氫氣可增強空間記憶，并降低氧化應激、Aβ、Bax和切割的半胱天冬酶-7水平[29]。盡管氫氣具有治療益處，但其對星形膠質細胞尿素循環代謝通路的影響仍有待探索。

因此，本研究旨在探討氫氣治療是否能減少星形膠質細胞尿素循環中有毒代謝物的積累，從而減緩神經退行性變和記憶喪失。我們假設，通過行為測試、生化檢測、蛋白質印跡、免疫組織化學（IHC）、免疫細胞化學（ICC）和基因表達分析評估，氫氣可下調5個家族性阿爾茨海默?。?xFAD）小鼠模型中尿素循環中有毒代謝物的積累，減少神經退行性變和記憶障礙。

2. 結果

2.1 吸入氫氣減輕5xFAD小鼠的記憶障礙

我們采用Morris水迷宮和Y迷宮實驗評估氫氣治療對5xFAD小鼠海馬依賴性空間學習和記憶障礙的影響。我們分析了Morris水迷宮實驗中的逃避潛伏期、路徑長度和經過時間。在第2-5天（隱藏平臺）的測試中，我們觀察到與溶媒處理的小鼠相比，氫氣處理的5xFAD小鼠的逃避潛伏期縮短了1.4倍，路徑長度縮短了2.0倍（圖1A、B）。在第6天的測試中，與溶媒處理的小鼠相比，氫氣處理的5xFAD小鼠的逃避潛伏期縮短了6.0倍（p<0.001；圖1C），路徑長度縮短了3.0倍（p<0.001；圖1D）；此外，氫氣處理的5xFAD小鼠進入目標象限（即經過時間）的次數是溶媒處理小鼠的6.0倍（p<0.01；圖1E），游泳模式進一步說明了這一點（圖1F）。對于Y迷宮實驗，我們分析了臂進入頻率（圖1G）、總距離（圖1H）和自發交替百分比（圖1I）。與溶媒處理的小鼠相比，氫氣處理的5xFAD小鼠的自發交替百分比顯著增加了2.7倍（p<0.01）（圖1I）。

圖1. 小鼠行為測試結果。Morris水迷宮結果，包括（A）試驗期間（第2-5天）的逃避潛伏期，（B）試驗期間（第2-5天）的路徑長度，（C）測試試驗（第6天）的逃避潛伏期，（D）測試試驗（第6天）的路徑長度，（E）測試試驗（第6天）的經過時間，以及（F）游泳模式。Y迷宮測試結果：（G）臂進入次數，（H）總距離，以及（I）自發交替。野生型小鼠和5xFAD小鼠用3%氫氣處理（每組n=7）。顯著性差異設定為*p<0.05，p<0.01，*p<0.001。H?，分子氫；5xFAD，5個家族性阿爾茨海默??；WT，野生型。

2.2 氫氣減少AβO處理的星形膠質細胞中的氧化應激并減輕神經炎癥

氧化應激增加和神經炎癥是阿爾茨海默病的典型病理生理學特征[12]。為了評估氫氣在調節這些病理標志物方面的治療效果，我們評估了AβO誘導的星形膠質細胞中的細胞內活性氧水平、過氧化氫酶抗氧化酶活性和促炎細胞因子。氫氣處理顯著減弱了AβO刺激的原代小鼠星形膠質細胞中活性氧的產生，與溶媒相比減少了1.2倍（p<0.05；圖2A）。此外，氫氣處理后過氧化氫酶活性增加了20%，盡管這一增加并不顯著（圖2B）。為了進一步研究氫氣在AβO刺激的原代小鼠星形膠質細胞中的抗炎潛力，我們使用qRT-PCR定量了常見神經炎癥標志物腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）的表達。我們觀察到與溶媒相比，腫瘤壞死因子-αmRNA水平顯著降低（p<0.05；圖2C），但白細胞介素-6表達的降低并不顯著（圖2D）。

圖2. 氫氣處理對體外阿爾茨海默病模型中氧化應激和炎癥標志物的影響。（A-D）經氫氣和溶媒處理的Aβ誘導的星形膠質細胞（2×10?個細胞/孔）中活性氧檢測、過氧化氫酶檢測、腫瘤壞死因子-αmRNA水平和白細胞介素-6的柱狀圖（每組n=3）。H?，分子氫；IL-6，白細胞介素-6；OS，氧化應激；ROS，活性氧；TNF-α，腫瘤壞死因子-α。實心圓和紅色柱代表氫氣處理，空心圓和白色柱代表溶媒處理。統計學顯著性設定為*p<0.05，p<0.01。

2.3. 氫氣降低5xFAD小鼠的氧化應激和神經炎癥

我們還評估了氫氣處理對5xFAD小鼠海馬組織中細胞內活性氧水平、過氧化氫酶抗氧化酶活性和促炎細胞因子的影響。我們發現了顯著的效果，與溶媒處理組相比，活性氧水平降低1.2倍（p<0.05；圖3A），過氧化氫酶活性增加1.4倍（p<0.01；圖3B）。與溶媒處理組相比，氫氣處理顯著抑制腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-6的mRNA表達，分別降低1.6倍（p<0.01）和1.3倍（p<0.05）（圖3C、D）。

圖3. 氫氣處理對體內阿爾茨海默病模型中氧化應激和炎癥標志物的影響。（A-D）經氫氣處理的小鼠中活性氧檢測（n=7）、過氧化氫酶檢測（n=4）、腫瘤壞死因子-αmRNA水平和白細胞介素-6的柱狀圖。野生型（n=3）和5xFAD（n=3）。5xFAD，5個家族性阿爾茨海默?。籋?，分子氫；TNF-α，腫瘤壞死因子-α；IL-6，白細胞介素-6；OS，氧化應激；ROS，活性氧。實心圓和紅色柱代表氫氣處理，空心圓和白色柱代表溶媒處理。統計學顯著性設定為*p<0.05，p<0.01。

2.4. 氫氣改善5xFAD小鼠和AβO誘導的原代星形膠質細胞的淀粉樣蛋白病理并減少有毒代謝物積累

淀粉樣蛋白斑塊可激活星形膠質細胞尿素循環，導致有毒代謝物積累，引發星形膠質細胞再激活、神經退行性變和記憶喪失[18]。為了評估氫氣處理對淀粉樣蛋白病理、膠質纖維酸性蛋白表達以及有毒代謝物（過氧化氫、氨和γ-氨基丁酸）積累的影響，我們利用小鼠和星形膠質細胞的海馬切片及裂解物進行了免疫組織化學、免疫細胞化學和生化檢測。我們首先分析了反映過氧化氫水平的活性氧水平，發現與溶媒處理的對照組相比，經氫氣處理的AβO誘導的星形膠質細胞和5xFAD小鼠中活性氧水平顯著降低（圖2A和圖3A）。接下來，我們進行了免疫組織化學檢測，觀察到在皮質（CTX）中，膠質纖維酸性蛋白中Aβ斑塊的積累減少2.8倍（p<0.001），在海馬CA1區（CA1）減少2.4倍（p<0.05），在齒狀回（DG）減少2.7倍，如圖4A、B所示。同樣，經氫氣處理的AβO誘導的星形膠質細胞中γ-氨基丁酸水平顯著低于溶媒處理的細胞（p<0.001）；后續的免疫細胞化學分析證實了這一點（圖4C、D）。對氨濃度的測量顯示，體外氨濃度略有降低，如圖4E、F所示。

圖4. 氫氣處理后的有毒代謝物水平。 （A）小鼠腦切片的免疫組織化學共聚焦圖像。（B）β-淀粉樣蛋白信號強度圖（n=4）。（C）用于檢測星形膠質細胞中γ-氨基丁酸信號的免疫細胞化學圖像。（D）γ-氨基丁酸強度圖（n=4）。（E、F）圖表顯示體外和體內檢測的氨濃度。統計學顯著性設定為*p<0.05，*p<0.001。H?，分子氫；CTX，皮質；CA1，海馬CA1區；DG，齒狀回；5xFAD，5個家族性阿爾茨海默??；GABA，γ-氨基丁酸；ICC，免疫細胞化學；IHC，免疫組織化學；VEH，溶媒；6E10陽性表示淀粉樣蛋白斑塊。箭頭表示淀粉樣蛋白斑塊，白色方框表示在顯微鏡下檢測的切片。

3. 討論

在本研究中，我們使用5xFAD轉基因小鼠和AβO誘導的原代星形膠質細胞，研究了小鼠暴露于3%氫氣60天以及星形膠質細胞暴露于3%氫氣3小時后，氫氣處理對星形膠質細胞尿素循環代謝物和酶的影響。分析的主要發現如下：（1）我們觀察到，經氫氣處理的5xFAD小鼠表現出顯著的記憶改善，這體現在Morris水迷宮測試中顯著增加的經過時間百分比和Y迷宮測試中更高的自發交替百分比（分別見圖1E、I）。這些表明，與溶媒相比，吸入3%氫氣顯著改善了5xFAD小鼠的空間記憶和學習能力。（2）在AβO誘導的星形膠質細胞培養物和5xFAD小鼠中，氫氣處理降低了氧化應激（即活性氧和過氧化氫酶活性）和炎癥標志物水平，處理組和溶媒組之間存在顯著差異（圖2A-D和圖3A-D）。這些發現表明，氫氣療法通過其抗氧化活性降低過氧化氫水平，以及通過抗炎機制降低腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-6基因表達，從而降低氧化應激和炎癥。因此，這表明在AβO誘導的星形膠質細胞和5xFAD小鼠中，氫氣通過減輕氧化應激和下調炎癥細胞因子表達而產生神經保護作用。觀察到的活性氧和促炎介質的減少，凸顯了氫氣作為一種針對阿爾茨海默病進展中氧化還原失衡和神經炎癥的藥物的治療潛力。（3）處理組的有毒代謝物水平顯著低于溶媒組，其中Aβ斑塊（以6E10陽性信號數量為代表）和γ-氨基丁酸存在顯著差異（圖4A-E）。這些數據表明，氫氣處理減少了有毒代謝物的積累，包括Aβ、過氧化氫和γ-氨基丁酸，與溶媒相比，氫氣處理后這些物質顯著減少。這表明氫氣處理后，由于膠質纖維酸性蛋白水平降低（表明星形膠質細胞增生減少），星形膠質細胞功能得到增強。

抗氧化防御系統是氫氣發揮功效的關鍵，其上游受核因子紅細胞2相關因子2（Nrf2）調控[33]。在氧化應激條件下，核因子紅細胞2相關因子2在Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1（Keap1）修飾后轉移到細胞核，并與抗氧化反應元件的啟動子區域結合。這種結合驅動許多抗氧化酶（包括過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶）的轉錄和隨后的表達[34]。通過這些機制，核因子紅細胞2相關因子2防止活性氧和活性氮物種對細胞的損傷，并維持氧化還原穩態[35]。近年來，關于氫氣醫學應用的研究有所增加，在臨床前模型和臨床受試者中采用了不同的氫氣給藥方法。這些方法包括吸入、攝入（溶解在水中）、靜脈注射和皮膚涂抹凝膠[36,37]。不同研究中氫氣的濃度各不相同。約1-4%的氫氣被認為是安全的[36]，據報道，吸入3%的氫氣可改善阿爾茨海默病患者的認知和彌散張量成像評分[38]。此外，觀察到吸入2%的氫氣可通過下調健康成年人的生物標志物水平來降低患阿爾茨海默病的風險。這些研究加深了我們對氫氣治療效果的理解[36,39]。然而，劑量和給藥途徑的差異使得這些發現難以比較[36,38,39]。此外，這些研究缺乏隨機性[38]，迄今為止，還沒有人研究過氫氣在阿爾茨海默病模型中調節與星形膠質細胞尿素循環相關的有毒代謝物的機制。

最近的研究[18,40]提出鳥氨酸脫羧酶1可作為阿爾茨海默病的合適治療靶點；然而，有研究表明，鳥氨酸脫羧酶1抑制劑二氟甲基鳥氨酸需要高劑量且具有毒性副作用[41,42]。此外，另一項研究報道，二氟甲基鳥氨酸處理組和對照組在鳥氨酸脫羧酶1抑制方面沒有顯著差異[43]。最近的一項研究提出，強直性γ-氨基丁酸可能靶向腦部疾病中的反應性星形膠質細胞，但需要進一步的證據來支持這一假設[44]。我們的研究顯示，用3%氫氣處理5xFAD小鼠后，其學習和記憶能力得到改善，這可能是由于氧化應激和炎癥標志物減少所致，與早期研究的結果一致[37,38,39,45]。

過氧化氫作為一種主要的活性氧，是星形膠質細胞尿素循環中產生的有毒次級代謝物；氫氣是過氧化氫的清除劑，從而減少神經退行性變。通過清除過氧化氫來降低氧化應激，可能是觀察到的Aβ水平降低的原因（圖4B），這與先前的研究結果一致[12,46,47]。此外，大腦中Aβ的積累可觸發星形膠質細胞的氧化應激和神經炎癥反應，導致神經元功能障礙和凋亡[12]。高水平的氧化應激誘導蛋白質氧化，導致Aβ形成[5]。我們的研究顯示，Aβ、氧化應激（表現為活性氧減少和過氧化氫酶活性增加）以及腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-6等炎癥標志物均有所減少，這表明神經退行性變有所減輕；這增強了神經元內信號傳遞，并防止了阿爾茨海默病的惡化，正如小鼠記憶改善所顯示的那樣（圖1E、I）。氧化應激的減少還意味著膠質纖維酸性蛋白區域中Aβ的共定位減少（圖4A、B），這表明星形膠質細胞死亡減少，其功能得到改善。此外，γ-氨基丁酸作為一種抑制性神經遞質，在星形膠質細胞尿素循環的最后一步產生，會導致阿爾茨海默病中的記憶障礙[17]。我們的結果顯示，γ-氨基丁酸水平降低（圖4D），這有助于經氫氣處理的5xFAD小鼠的記憶改善。

然而，缺乏特定尿素循環中間產物和酶以及抗氧化防御通路上游標志物（如核因子紅細胞2相關因子2）的代謝組學和蛋白質組學分析，限制了我們廣泛評估氫氣處理的完整代謝影響的能力。未來的研究納入整合蛋白質組學和代謝組學分析，對于描述氫氣介導的星形膠質細胞尿素循環調節的全部范圍至關重要。盡管如此，我們的發現表明，氫氣可抑制有毒尿素循環代謝物的積累，從而減輕阿爾茨海默病模型中的神經退行性變和記憶喪失。

4. 材料和方法

4.1. 動物和細胞培養模型

所有動物均按照延世大學原州醫學院機構動物護理和使用委員會的指南進行管理，該委員會批準了本研究的倫理許可（倫理批準號：YWC-240423-2）。使用5周齡的雄性和雌性小鼠（n=29），包括過度表達淀粉樣前體蛋白（APP）和早老素1（PSEN1）的轉基因5xFAD小鼠（n=14）[48,49]以及C57BL/6野生型（WT）小鼠（n=15）。5xFAD轉基因小鼠（RRID:MMRRC_034848-JAX）購自杰克遜實驗室（美國緬因州巴爾港；庫存編號：008730）。通過將轉基因小鼠與F1 C57BL/6小鼠交配培育半合子品系，并使用聚合酶鏈反應（PCR）確認其基因型。用于基因分型的引物信息如表A2所示。小鼠被飼養在12:12小時光/暗周期的籠子里，可自由獲取食物和水。處理組（野生型，n=8；5xFAD，n=7）通過氫氣發生裝置（GOOTZ有限公司，韓國楊州市）吸入3%氫氣，持續60天。相比之下，溶媒處理組（野生型，n=7；5xFAD，n=7）接受正常通風。野生型氫氣處理組有1只死亡。60天后，進行行為測試，處死小鼠，取出其大腦并保存以供進一步分析。通過勻漿20mg組織制備腦裂解物，并使用BCA測定法測定蛋白質濃度。每個樣品標準化為5mg/mL蛋白質。

為了進行體外實驗，我們使用1日齡C57BL/6小鼠幼崽制備原代皮質星形膠質細胞培養物。解剖大腦皮質，將其切碎并分離為單細胞。然后，我們將細胞接種在0.1mg/mL聚-D-賴氨酸包被的培養板中。細胞在含有4.5g/L葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、10%熱滅活胎牛血清（SIGMA-ALDRICH，美國加利福尼亞州卡爾斯巴德）和5%青霉素-鏈霉素的達爾伯克改良伊格爾培養基（Gibco，英國佩斯利）中培養。培養的細胞在37°C、5%二氧化碳的濕潤條件下維持。三天后，用新鮮培養基沖洗細胞，去除漂浮的細胞碎片，并更換培養基[50]。

然后，將原代星形膠質細胞培養物在單獨的6孔板（2×10?個細胞/孔）中培養，以進行進一步的實驗。AβO會加速阿爾茨海默病的進展[3]；因此，為了評估氫氣處理在AβO誘導的星形膠質細胞中的作用，其中一個培養板中的細胞用1μM AβO（rPeptide，美國佐治亞州沃特金斯維爾）誘導5天，并置于連接到氫氣發生裝置（GOOTZ有限公司，韓國楊州市）的FLUXLUK細胞處理室中，總時長為3小時，間隔30分鐘，氫氣濃度設定為3%。在另一個培養板中，用氫氧化銨（即溶媒）處理細胞，處理時間相同。AβO的制備方法是：將1%冰冷的氫氧化銨（NH4OH）加入分裝到1.5μL微量管中的Aβ單體中，并在-80°C下儲存直至需要使用。

體內和體外實驗的處理持續時間不同，這是由于生物學背景和實驗限制的差異。在小鼠模型中，需要延長60天的暴露時間，以模擬阿爾茨海默病樣病理的慢性進展。相比之下，體外原代星形膠質細胞對環境壓力更敏感，特別是在非標準培養條件下（如FLUXLUK培養箱中）。因此，為了避免誘導細胞應激或死亡，氫氣暴露被限制在總計3小時的短時間間隔內，這是類似的體外抗氧化處理研究中常用的方法。這種短期暴露足以評估星形膠質細胞對AβO和氫氣處理的保護或調節反應。

4.2. 行為學測試

記憶障礙是阿爾茨海默?。ˋD）的一個典型特征[20]。為了評估氫氣（H?）對5xFAD小鼠認知行為的影響，我們采用Morris水迷宮和Y迷宮來評估其空間學習能力和短期記憶[51,52]。所有行為學測試均采用雙盲法，僅在數據分析完成后才揭盲。Morris水迷宮測試按照Bromley-Brits等人[53]發表的方法進行。簡要來說，將每只小鼠小心放置在第一個象限中，讓其游泳并尋找可見的平臺。60秒內未能找到平臺的小鼠會被輕輕引導至平臺，并在平臺上停留10秒。該操作對每只小鼠在所有象限中重復進行，持續五天。從第2天到第5天，平臺被隱藏起來以評估空間學習能力。第6天，平臺被完全移除，將小鼠分別放置在距離目標象限最遠的象限中，讓其探索60秒。每只小鼠的逃避潛伏期和路徑長度由五次試驗的平均值確定。使用攝像機（Panlab Harvard Apparatus，美國馬薩諸塞州霍利斯頓，Panlab SMART視頻跟蹤系統Smart 3.0，Harvard Apparatus）跟蹤并記錄小鼠的運動，隨后對數據進行分析以評估其表現。在第六天，通過分析逃避潛伏期、路徑長度和經過時間來評估空間記憶和學習能力。

在Y迷宮測試中，將小鼠單獨放置在迷宮中央（Jeongdo B&P有限公司，韓國首爾），迷宮有三個相同的臂（彼此成120°角），讓小鼠探索8分鐘。只有當小鼠的四肢都進入臂內時，才記錄為一次進入。我們使用上述視頻跟蹤方法，并分析臂進入頻率和自發交替行為[52]。

4.3. 有毒代謝物水平的評估

Ju等人[18]報道，在正常情況下，星形膠質細胞通過尿素循環清除氨、γ-氨基丁酸（GABA）和過氧化氫（H?O?）等有毒代謝物。然而，在阿爾茨海默病中，這些代謝物會積累，引發氧化應激（OS）、神經炎癥和細胞凋亡，導致神經退行性變和記憶喪失。我們通過生化檢測、免疫組織化學（IHC）和免疫細胞化學（ICC）研究了氫氣對這些有毒代謝物水平的影響。

4.3.1. 活性氧和抗氧化酶檢測

使用2,7-二氯熒光素二乙酸酯（DCF-DA）（EMD Millipore公司，中國北京）測量細胞內活性氧（ROS）水平，特別是過氧化氫的水平。簡要來說，在體內實驗中，將10μL海馬裂解物（5mg/mL）和100μL 20μM DCF-DA分裝到96孔板中。然后將板在暗處孵育30分鐘。孵育后，使用DTX-880微孔板讀數儀（Beckam Counter公司，美國加利福尼亞州富勒）在488nm激發/525nm發射波長下測量熒光。對于體外實驗，原代星形膠質細胞在6孔板（2×10?個細胞/孔）中培養，并用1μM AβO（rPeptide公司，美國佐治亞州沃特金斯維爾）誘導5天，然后用3%氫氣或1%氫氧化銨處理3小時，并用1×磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）（Lonza公司，美國馬里蘭州沃克斯維爾）洗滌兩次；按照上述方法進行熒光檢測。

使用Amplex Red過氧化氫酶檢測試劑盒（Invitrogen公司，美國加利福尼亞州卡爾斯巴德）定量抗氧化酶活性。過氧化氫酶分解過氧化氫，產生水和氧氣，從而防止細胞損傷[54]。因此，將25μL每個樣品（5mg/mL）和對照分別加入板上相應的孔中。接下來，加入25μL 40μM過氧化氫溶液，并將內容物在約25-37°C下放置30分鐘。然后我們加入50μL 100μM Amplex Red試劑/0.4U/mL辣根過氧化物酶，將板在37°C下孵育30分鐘。隨后，使用SpectraMax ABS Plus微孔板讀數儀（Molecular Devices公司，美國加利福尼亞州圣何塞）在560nm處測量吸光度。熒光變化計算為無過氧化氫酶對照的熒光減去樣品的熒光。

4.3.2. 氨檢測

為了定量AβO誘導的原代星形膠質細胞培養物和小鼠腦組織中的氨濃度，我們按照產品說明書使用氨檢測試劑盒（Sigma-Aldrich公司，美國密蘇里州圣路易斯）。使用蒸餾水和離心將細胞（2×10?個細胞/孔）或海馬裂解物（5mg/mL）制成均勻混合物。將上清液的pH值優化至7-8，并將100μL該上清液放入比色杯中。向比色杯中加入L-谷氨酸脫氫酶溶液，充分混合，并在18-35°C下孵育5分鐘。然后，如上所述，使用微孔板讀數儀在340nm處測量吸光度。

4.3.3. 免疫組織化學和免疫細胞化學

為了確定3%氫氣處理是否減少5xFAD小鼠海馬中Aβ的積累，我們按以下方法進行免疫組織化學。將切除的小鼠大腦左半球用4%多聚甲醛在4°C下固定過夜，并在30%蔗糖中脫水2天。使用低溫切片機將海馬切成30μm的冠狀切片。切片在4°C下儲存；用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌，然后浸入封閉緩沖液（由5%山羊血清、0.1M磷酸鹽緩沖鹽水和0.3%Triton X-100組成）中1小時。接下來，將切片在含有一抗（Dako公司，美國加利福尼亞州卡平特里亞）的封閉緩沖液中，在4°C下振蕩孵育至第二天。然后用含有0.03%Triton X-100的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌三次以去除未結合的抗體，并在室溫下與二抗孵育1小時。重復洗滌，加入磷酸鹽緩沖鹽水中的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（1:1500稀釋）；隨后用熒光封片劑（Cell Signaling Technology公司，美國馬薩諸塞州丹弗斯）封片，并使其干燥。使用共聚焦顯微鏡和Zeiss LSM880顯微鏡（Zeiss公司，德國耶拿）拍攝熒光圖像。使用ImageJ軟件（1.41版本，美國國立衛生研究院，馬里蘭州貝塞斯達）處理圖像。一抗和二抗的信息如表A2所示。

采用免疫細胞化學分析氫氣對γ-氨基丁酸積累的影響。簡要來說，用3%氫氣或溶媒處理的AβO誘導的星形膠質細胞用4%多聚甲醛固定15分鐘，并在腦脊液中反復洗滌（三次）。使用含有0.2%Triton X-100的磷酸鹽緩沖鹽水滲透固定的細胞，并在室溫下封閉1小時。然后將細胞與小鼠抗γ-氨基丁酸一抗（Millipore公司，澳大利亞維多利亞州貝斯沃特）在4°C下孵育1小時。接下來，將細胞與二抗和DAPI（Vectashield?，美國加利福尼亞州紐瓦克）孵育40分鐘。每次孵育后，用含有0.1%Triton X-100的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌三次。按照上述免疫組織化學的方法進行成像和分析。

4.4. 炎癥基因的逆轉錄-定量聚合酶鏈反應分析

為了評估氫氣如何影響炎癥細胞因子基因的表達，我們對AβO誘導的星形膠質細胞（2×10?個細胞/孔）和小鼠海馬裂解物（5mg/mL）進行了逆轉錄-定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）。首先，使用easy-BLUETM總RNA合成試劑盒（iNtRON Biotechnology公司，韓國城南市）從星形膠質細胞和海馬裂解物中提取RNA。使用PrimeScriptTM第一鏈cDNA合成試劑盒（Takara公司，韓國首爾）將提取的RNA（標準化為1μg）逆轉錄為cDNA。cDNA文庫制備后，按照Kwak等人[55]描述的方法進行逆轉錄-定量聚合酶鏈反應。簡要來說，樣品一式三份制備，最終體積為10μL，包括1μL 10pM引物、2μL cDNA、5μL SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems公司，英國沃靈頓）和2μL無RNA酶水；這些樣品在QuantStudio 6 Flex實時PCR系統（Applied Biosystems?，新加坡馬西嶺工業區路3號）中進行分析。以GAPDH mRNA作為參照，使用2-??CT法確定折疊變化。本實驗中使用的引物列于表A1中。

4.5. 統計分析

我們使用GraphPad Prism軟件（8版本；GraphPad Software公司，美國加利福尼亞州拉霍亞）分析數據。采用雙因素方差分析和多重比較檢驗（Tukey事后檢驗）檢測差異，顯著性水平設定為p<0.05。實驗樣品的數據以平均值和標準誤表示。除非圖注中另有說明，否則個體小鼠或培養細胞批次以單個數據點和樣本表示。

5. 結論

我們的研究結果表明，氫氣處理有效減輕了AβO誘導的星形膠質細胞和5xFAD轉基因阿爾茨海默病小鼠模型中有毒代謝物、氧化應激和炎癥標志物的積累。此外，3%氫氣給藥降低了星形膠質細胞尿素循環的有毒副產物過氧化氫和γ-氨基丁酸的水平，從而起到神經保護作用。這些生化指標的改善與認知能力的增強相關，5xFAD小鼠的學習和記憶能力提高證明了這一點。據我們目前所知，這是第一項探索氫氣在阿爾茨海默病模型中靶向星形膠質細胞尿素循環內有毒代謝物積累的治療潛力的研究。這些發現表明，氫氣可能通過調節阿爾茨海默病中星形膠質細胞介導的代謝功能障礙，成為一種新型且有前景的減輕神經退行性變的策略。盡管如此，仍需要詳細的蛋白質組學和代謝組學分析來闡明氫氣對星形膠質細胞尿素循環中間產物和酶的影響。

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