流式細胞術中的對照設置，這一篇就夠了！

小夢想在努力 2021-07-15

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陰性對照的設置

不僅熒光素能夠在激光的激發下產生熒光，細胞表面的某些分子或者結構也能夠產生熒光，這種熒光相對于熒光素產生的熒光較弱，而且與細胞表面的特異抗原分子沒有相關性，被稱為非特異性熒光。所以，在特定的激光激發下，細胞產生的熒光并不是絕對的有和無，細胞表面不結合流式熒光素時也會產生熒光信號。

每一種細胞都會產生非特異性熒光，流式檢測時得到的熒光信號是細胞本身的非特異性熒光和來自于細胞表面結合的熒光素的特異性熒光疊加得到的結果。所以分析流式結果時，不能因為得到了熒光信號就判斷細胞表面肯定結合有相應的熒光素，從而判斷細胞表達相應的抗原分子，而應該比較該熒光信號與細胞的非特異性熒光，如果得到的熒光信號大于非特異性熒光，說明得到的熒光信號部分來源于熒光素的特異性熒光，就可以判斷細胞表達相應的抗原分子。所以，確定與熒光素無關的細胞自身的非特異性熒光的強弱非常重要，此時就需要設立陰性對照。

圖中是3類陰性對照和標記熒光素偶聯抗體(抗CD69-PE)得到的熒光信號的示意圖。相比于前面3類陰性對照，可以得出這群樣品細胞中有30％的細胞表達有CD69抗原分子。如果沒有陰性對照作為參照，直接根據最后標記熒光素偶聯抗體組的熒光信號無法判斷樣品細胞中有多少比例的細胞表面結合有PE熒光素，從而也就無法判斷有多少比例的細胞表達CD69抗原分子。

這3類陰性對照是比較全面的陰性對照：

第1類“negative”表示的是不加任何熒光素偶聯抗體時得到的熒光信號，因為沒有標記任何熒光素，所以這組得到的熒光信號與熒光素無關，與細胞抗原分子是否表達無關，得到的熒光信號代表的是非特異性熒光信號；

第2類“抗CD69”表示的是用抗CD69抗體標記樣品細胞后得到的熒光信號，雖然抗CD69抗體能夠與細胞表面的CD69抗原分子結合，但是抗CD69抗體沒有偶聯熒光素，所以得到的熒光信號也與細胞表面是否表達有CD69分子無關，得到的熒光信號代表的也只是細胞本身的非特異性熒光，所以這種對照用于排除抗體的影響；

第3類“IgG1-PE”表示的是標記與抗CD69抗體同種屬（來源于同一物種）且同類（抗CD69-PE中的抗體是IgG1類的）的非特異性抗體（IgG1）與PE熒光素偶聯的同型（isotype）對照抗體（IgG1-PE）后，得到的熒光信號，這種同型對照抗體不能與細胞表面的CD69發生特異性結合，所以細胞表面不會結合有IgG1-PE，最后得到的熒光信號不是PE熒光素產生的特異性熒光信號，而是代表細胞本身的非特異性熒光，所以這種對照用于排除熒光素的影響。

陰性對照的設置是流式細胞術中非常重要的一個步驟，每次流式分析時都必須設置陰性對照。設置陰性對照不需要如圖所示的3種陰性對照全部設置齊全，一般只需要設置1種陰性對照就可以了。

第1種陰性對照是最簡單也是最為常用的對照，每次流式分析時多準備一份樣品細胞，不標記任何熒光素偶聯抗體，在流式上樣時先檢測這份樣品細胞，設定各個通道的電壓，再根據其非特異性熒光信號值標記陰陽性分界線，然后再檢測標記有各種熒光素偶聯抗體的樣品細胞，熒光信號值在陰陽性分界線以上的細胞為陽性細胞。當實驗要求不高、已進行預實驗或者能夠確定同型對照的熒光信號與不加同型對照的這種陰性對照結果一致時，就可以采用這種陰性對照的設置。

第2種陰性對照設置方法只是一種理論上的設置方法，是為了便于理解陰性對照的設置原理才列于此處，一般流式分析時不會應用到這種陰性對照。

第3種陰性對照的設置方法，稱為同型對照設置，是常規的陰性對照設置法，正式的流式圖的數據都必須建立在這種同型對照的基礎之上，在同型對照基礎上得出的流式結果是最可靠的。

細胞的非特異性熒光的強弱由細胞本身所決定，與細胞的體積大小有關，一般細胞體積越大，其非特異性熒光就越強；體積越小，其非特異性熒光就越弱。如實體臟器細胞或者腫瘤細胞比免疫細胞的非特異性熒光要強：同是免疫細胞，體積較大的巨噬細胞的非特異性熒光要強于體積較小的淋巴細胞；而細胞體積相同的T細胞與B細胞，它們的非特異性熒光強度相差不多。所以，分析每一種樣品細胞時，都需要設定這種樣品細胞的陰性對照，不能用一種細胞的陰性對照值分析另外一種細胞，尤其是在體積相差較大時更不能互相借用陰性對照值，如不能將腫瘤細胞的陰性對照結果用于分析免疫細胞。

FMO對照

減一陰性對照（fluorescence-minus-onecontrol，FMO對照）是一種特殊的陰性對照，是指在多色（通道）分析時對其中某一個通道特別設置的陰性對照，多在研究不同細胞亞群表達某些重要的表型分子、細胞因子等時應用。

如需要研究人PBMC中CD62L+CD4+和CD62L-CD4+兩個細胞亞群表達CD45RA這個重要表型分子的表達情況時，需要同時標記不同熒光素偶聯的抗人CD4、CD62L和CD45RA抗體，除了常規的陰性對照設置，最好再設置一組FMO對照，就是只標記熒光素偶聯抗人CD4和CD62L抗體，而不標記熒光素偶聯的抗人CD45RA抗體，然后將CD62L+CD4+和CD62L-CD4+細胞亞群分別設門，將兩群細胞分別顯示于新的散點圖中，散點圖上其中一個軸代表CD45RA的熒光信號，這時就可以分別設置這兩個細胞亞群CD45RA通道的陰陽性界線，然后再上樣分析實驗組，根據不同細胞亞群各自的陰陽性界線分別判定細胞亞群各自表達CD45RA的情況。這種特殊的陰性對照就是FMO對照。

因為不同細胞亞群的非特異性熒光可能存在差異，而且不同細胞亞群結合有不同的熒光素偶聯抗體從而使它們的最佳補償值存在差異，當在統一的補償條件下同時分析時，不同細胞亞群在某一通道的陰陽性界線就可能存在差異，普通陰性對照無法進一步區分這種差異，而FMO對照就可以通過只缺少標記這一通道代表的熒光素偶聯抗體，精確界定不同細胞亞群各自的這一通道的陰陽性界線，從而使流式分析結果更加精確。

陽性對照的設置

設置陽性對照，就是在使用某種熒光素偶聯抗體前先采用一定的方法檢測該熒光素偶聯抗體是否有效。

陽性對照并不是毎次進行流式分析時都必須設置，一般在遇到以下情況時設置:

（1）使用新的熒光素偶聯抗體時，該熒光素偶聯抗體以前沒有使用過

（2）換用不同公司的或者同一公司但不同批號的熒光素偶聯抗體時。

（3）使用儲存時間較長的熒光素偶聯抗體時。

以上三種情況都可能會因為各種原因如生產、運輸或者保存不當等導致熒光素偶聯抗體失效，從而無法正常標記樣品細胞，此時即使細胞表達有相應的抗原分子，這種失效的熒光素偶聯抗體也有可能無法與抗原分子結合產生特異性的熒光信號，得到假陰性的結果。

設置陽性對照，檢測熒光素偶聯抗體是否有效，一般有兩種方法：

①肯定表達有相應抗原分子的樣品細胞來檢測，如檢測熒光素（不管哪種熒光素）偶聯的抗小鼠CD4抗體，可以用該抗體標記正常小鼠的脾臟細胞，因為該細胞內肯定有CD4陽性細胞，而且已知CD4陽性細胞占脾臟細胞的大致比例范圍，所以如果用該抗體標記脾臟細胞得到意料中的結果時，就可以認為該抗體有效；

②如果實驗室有已證明有效地與待測熒光素偶聯抗體的單克隆抗體相同但偶聯的熒光素不同的熒光素偶聯抗體，如需檢測FITC偶聯的抗小鼠CD4抗體（FITC-CD4抗體）是否有效，實驗室已有證明有效的PE偶聯的抗小鼠CD4抗體（PE-CD4抗體），這時可以用這兩種熒光素偶聯抗體同時標記同一份肯定表達有相抗原分子（CD4分子）的樣品細胞，流式檢測后如果PE陽性的細胞FITC也是陽性的，PE陰性的細胞FITC也是陰性的，就可以證明該待測的熒光素偶聯抗體有效。