1.腫瘤克隆進化介紹腫瘤克隆進化是腫瘤研究中的宏偉命題，分析腫瘤樣本中細胞群結構，可以針對性靶向腫瘤細胞治療。這里針對發表在Nature Methods期刊上的綜述解讀腫瘤進化研究內容。 腫瘤具有較強的瘤內異質性，攜帶不同體細胞突變的腫瘤細胞群稱為克隆。克隆比例隨著腫瘤發展和治療而變化。針對亞克隆結構分析主要有以下三個方面：（1）利用體細胞突變分析主要細胞群；（2）定量每個克隆比例；（3）構建不同克隆系統發育路徑。 取樣和測序在研究腫瘤克隆進化時，單樣本高深度測序會低估亞克隆數量，或者亞克隆被誤認為是主克隆。而多區域取樣本測序則可以提高亞克隆分辨率，有利于發育路徑構建；同時增加測序深度可以區分相似CCF的亞克隆。因此，「測序更多樣本比高深度測序更有利于構建亞克隆」。如圖所示，Donor1的a、b、c三個區域取樣，每個區域可以獲取含有不同的克隆；Donor2用三個樣本構建腫瘤系統發育路徑要比兩個樣本更加準確：單個個體取a和c兩個樣本時，發現紫色代表的是主克隆，再增加b樣本后，發現b樣本不存在紫色克隆，因此是作為亞克隆存在。多樣本測序可以是不同區時間取樣（原發/復發），分析腫瘤進化時間特征；也可以是多位置取樣（原發或者轉移腫瘤多位置取樣），分析亞克隆比例。 測序深度測序覆蓋度和測序技術影響深度分布，進而影響克隆和亞克隆SNV檢測的敏感性和特異性。腫瘤純度和倍性也影響低CCF的SNV檢測測序深度。 測序深度主要利用每條腫瘤染色體的reads數評估（NRPCC, The number of reads per tumor chromosomal copy）。NRPCC增加，真實的CCF值更清晰，更容易區分克隆簇。該方法主要通過腫瘤純度和倍性推測合適的測序深度。癌癥單樣本研究，大部分樣本至少一個克隆NRPCC＞10；NRPCC=10，代表純度為50%的二倍體腫瘤測序深度為40x。 假如腫瘤倍性ψT=4，純度ρ=0.7；ψ= 0.7×4+0.3×2=3.4，如某SNV的CCF為0.33，該突變reads占腫瘤細胞reads比例f為：，突變reads數N=f×d，因此N=NRPCC×CCF 將突變reads數量根據二項分布建模，N~Bin（f, d）。例如少于5%突變不被檢測，則N＜3的概率為P＜0.05 P（N＜3）＜0.05 → → d≥91 說明測序深度必須＞91x，對應NRPCC=18.7；對于CCF=1的克隆，深度必須＞29x 測序寬度WES檢測CCF是比WGS和TRS更準確的。30~50× WGS實現高質量的CNA和估計亞克隆拷貝數CCF檢測。但高深度測序可以準確評估CCF，和WGS相比，WES可以通過檢測更多的SNV/InDel和少量的CNA準確實現亞克隆分析，并且實現對多樣本測序并減少測序成本。TRS panel含有較少的基因對于等位基因特異性CNA分析是不可信的。文章對于亞克隆構建分析，推薦使用冰凍組織；因為FFPE樣本的質量是不可控的，會引入CNA錯誤。如果必須要采用FFPE樣本作為試驗材料，需要優化建庫和分析條件，確保檢測準確的SNV和CNA。 2.克隆進化分析克隆進化，主要從攜帶不同突變的腫瘤細胞比例維度構建系統發育路徑，揭示克隆進化關系。克隆進化分析主要原理是利用VAF或者將VAF轉化為攜帶某突變的細胞比例（CCF或CP）進行聚類分析，根據聚類簇的數量確定亞克隆的數量以及通過相關算法判斷進化關系。進化樹上每個分支終點代表不同克隆。主要采用兩種方法分析：一種是SNV或SNV與CNA結合分析克隆進化結構；另一種是采用CNA構建進化關系。下面主要介紹這兩方法的原理。 （1）SNVa.原理利用腫瘤純度和拷貝數將突變等位基因頻率轉化為CCF或者CP。CNV導致SNV 支持reads數變化，因此這個過程中利用CNV校正VAF轉化為CCF或者CR是重要的一步，或者利用正常二倍體區域的SNV聚類。二倍體區域的突變聚類適用于主要的亞克隆分析，細胞比例等于2倍的VAF，其中較高的CP為主克隆。錯誤來自于聚類數量錯誤估計或SNV錯誤分配。使用不當的噪音模型會導致高估或低估聚類數目。二項噪音分布可以捕捉read深度、拷貝數狀態和CP準確評估SNV 的VAF。在VAF轉化為CCF時也要當心，亞克隆CNV導致SNV 多重性（攜帶突變DNA的拷貝）增加，而且錯誤CNV分析可能會導致CCF＞1。 SNV聚類基于幾個癌癥進化的假設：① 大多數檢測到VAF的SNV與少量的亞克隆相關（「弱簡約性假設」）。細胞分裂產生的頻率較低的陽性突變干擾體細胞突變檢測，也說明亞克隆的突變是通過篩選和早期漂變決定的。低VAF的聚類可能包含多種中性平行生長的細胞；② 腫瘤發展過程中，一個特定的基因組位置只發生一次SNV，并永遠不會恢復為germline堿基狀態（「無限位點假設」）。每一個SNV被唯一地分配到亞克隆簇中，但無限位點假設可能會被打破，例如存在平行進化的細胞群中發生同樣的驅動SNV或者三等位基因。這些事件發生比例較低，因此對SNV聚類影響較小。 亞克隆的染色體片段缺失導致該亞克隆體細胞突變消失，會打破無限位點假設。這種情況是比較常見的，并且導致假性聚類。除了忽視該區域的突變以外，還可以用Dollo構建亞克隆，假設突變僅發生一次但是后續可以消失（僅一次）。 大多方法也根據聚類數量和密度采用隱藏假設。聚類方法基于狄利克雷，具有重要的集中參數，來自于數據或者受到較強的先驗約束。 Tip：最大簡約性：生物演化應該遵循簡約性原則，所需變異次數最少（演化步數最少）的演化樹可能為最符合自然情況的系統樹 b. 問題① 當兩個亞克隆具有相似的細胞比例時，VAF分布是重疊的，弱簡約性不能將VAF更好分配給cluster。信息缺乏情況下，聚類算法會合并以上亞克隆。不確定SNV分配時，該種方式聚類在亞克隆鑒定和比例分析上具有較高可信度。 ② 變異檢測準確度影響聚類準確度。當germline SNPs被誤檢測為somatic SNV，導致CCF＞1，這樣的cluster中只有較少的SNV被聚類，具有特異性的突變特征（C>T和T>C）和包含較少或者沒有CNV。通過過濾數據庫和較高深度正常樣本測序減少以上情況。但過濾數據增加假陰性somatic SNV的數量，導致低頻率亞克隆細胞比例被高估。 ③ 算法假設二倍體中性狀態與男性性染色體突變是有沖突的。主要解決辦法是排除這些染色體上的突變。 「Tips」：（1）CCF (Cancer cell fraction)：攜帶某一系列突變的癌細胞占總癌細胞的比例。CCF=CP/purity. 突變頻率VAF (f)，腫瘤純度 (ρ)，局部拷貝數 (NT) 和突變多重性(m)。 （2）Cellular prevalence (CP)：某一測序樣本中，攜帶某一突變細胞的比例（含腫瘤和正常細胞）。 （3）突變多重性 (Multiplicity of a mutation, m)：攜帶突變的DNA拷貝數量，。在克隆拷貝數區域，突變多重性是嚴格的正整數，因此通過舍入到最近的非零整數獲取可能值 c. 發育樹構建原理弱簡約性和無限位點假設限制系統發育和細胞比例一致性。假設SNV只突變一次并且不恢復到germline 狀態，說明子代亞群繼承祖先細胞所有突變。祖先細胞比例必須大于等于它直接子代細胞比例之和。例如：子代細胞B和C具有共同祖先A，B和C之間關系未知；如果B的細胞比例大于C細胞比例，并且B細胞比例+C細胞比例＞A細胞比例，那么B一定是C的祖先，呈現線性進化（「鴿巢原理/sum rule」）。 單個樣本較難確定分支進化關系。在單個樣本中，當SNV聚類的細胞比例與祖先或子代CNA不兼容時，被認為是分支進化；當同一個染色體拷貝數附近或重疊區域的SNV通過read phasing發現是互斥的，會被認為是分支進化。 多樣本能夠較好分析亞克隆系統發育關系。例如 在某一樣本中，B細胞比例＞C細胞比例，但在另外一個中，C細胞比例＞B細胞比例，B和C一定是分支進化，為“親兄弟或表兄弟”關系。樣本的越多，將會更好構建分支進化（「crossing rule」）。 注意：染色體缺失導致亞克隆突變缺失，并且違反無線位點假設，如果忽略將會導致多樣本或單樣本系統發育構建出錯。 d. 分析軟件CCF & clusteringPhyloWGS：https://github.com/morrislab/phylowgs PhyloWGS是PhyloSub的升級版，結合somatic mutation和CNV計算克隆比例，包含三種系統發育關系可能性：（1）體細胞突變發生在CNV之前；（2）體細胞突變發生在CNV之后；（3）體細胞突變和CNV獨立發生。采用無限位點和弱簡約性假設。當發育關系具有多種可能時，利用馬爾可夫鏈蒙特卡爾理論（MCMC）從后驗概率模型中選取發育關系。實現克隆分析和系統發育樹構建。 WGS 20~30x可以滿足檢測3或4個克隆，200~300x可以達到6個克隆。數據：文獻采用的WGS數據，推薦30~50x CloneHD：https://github.com/andrej-fischer/cloneHD 適用于時序和空間多樣本。考慮CNV（read 深度和BAF）和somatic SNV。利用以上數據進行耦合隱馬爾可夫模型推斷進化關系，但不能輸出進化發育樹結果。Fischer A, Vázquez-García I, Illingworth CJR, Mustonen V. High-definition reconstruction of clonal composition in cancer. Cell Rep. 2014 Jun 12;7(5):1740-1752 PyClone：http://compbio./software/pyclone/ 采用無限位點和弱簡約性假設，利用貝葉斯層次模型分析深度測序獲取的somatic mutations（深度＞100x）和CNV結果。Pyclone輸出模型參數-后驗密度，經過處理得到每個輸入突變的克隆比例和聚類結果。 原理：4個模型：（1）beta-binomial emission densities，對含有更多變異的數據進行克隆比例建模更有效；（2）對可能的突變基因型采用靈活的先驗概率估計，反應等位基因比例與倍性相關和CNV事件一致；（3）貝葉斯非參數聚類，獲取突變聚類和聚類類別；（4）同一種癌癥多個聯合樣本，利用不同樣本克隆群共享。不能構建進化樹。 DPClust：https://github.com/Wedge-Oxford/dpclust 輸入拷貝數變異和SNV VAF，可以輸入phasing過的CNV和SNV。利用層次貝葉斯狄利克雷方法對克隆突變和亞克隆突變建模聚類。dpclust3p可以判斷SNV和CNV關系，識別SNV多重性。再利用DPClust聚類。不能構建進化樹。Nik-Zainal S, Van Loo P, Wedge DC, et al. The life history of 21 breast cancers. Cell. 2012 May 25;149(5):994-1007 SciClone: https://github.com/genome/sciclone 利用拷貝數正常區域和非雜合性缺失（LOH）區域的SNV（不限于SNV）計算克隆性。變分貝葉斯混合模型（variational Bayesian mixture model, VBMM）聚類SNV。可以輸入拷貝數等校正后的SNV進行聚類。適用于WES數據、WGS數據和SNP芯片數據 Miller CA, White BS, Dees ND, et al. SciClone: inferring clonal architecture and tracking the spatial and temporal patterns of tumor evolution. PLoS Comput Biol. 2014, 10(8):e1003665. PhylogicNDT：https://github.com/broadinstitute/PhylogicNDT PhylogicNDT Clustering 利用多維度狄利克雷原理分析細胞群和基因組發育關系：（1）避免偏差，評估克隆數量和細胞比例的后驗概率；（2）利用發育樹的約束條件評估最可能系統發育樹。輸入拷貝數、腫瘤純度和突變結果。Cluter上的CCF值非參數分布服從狄利克雷過程；狄利克雷迭代聚類后，再利用馬爾可夫鏈蒙特卡羅(MCMC)吉布斯采樣器縮減每個cluster內的突變，計算被移除的突變被分配到別的cluster的概率。PhylogicNDT BuildTree 構建進化樹。根據馬爾可夫鏈蒙特卡羅(MCMC)吉布斯采樣器每次迭代移動分枝，根據樹枝整合到特定位置的多項式概率。多項式概率根據鴿巢原理計算。適用于WES和WGS數據 進化關系如圖所示，腫瘤樣本具有4個克隆，最終構建系統發育關系時，有兩種符合進化關系，如果選擇最優克隆進化樹，需要更進一步分析。以下介紹幾個構建系統發育關系的軟件，在上述軟件聚類得到克隆簇后，克隆之間的演化關系也可以用以下方法分析。 CITUP：http:///projects/citup/ 基于無限位點假設和高深度測序（500~1000x）聚類突變，采用高斯噪音模型不適用于低深度測序數據。基于精確的二次整數規劃（Quadratic Integer Programming, QIP）公式構建進化樹。 ClonEvol：https://github.com/hdng/clonevol ClonEvol對cluster數據進行克隆排序和構建進化樹。利用自舉法縮減每個樣本的突變數量，再計算克隆CCF，評估每個克隆CCF值的置信區間。利用sum rule和crossing rule推斷無性系進化樹（如克隆排序），克隆排序的概率估計是否違背以上理論；對每個樣本進行進化分析，合并成一致性進化樹復合每個樣本內的進化關系。可視化數據和克隆進化樹。 不同的克隆進化檢測軟件也可以在網頁中使用。網頁版軟件集合：https://www./cun-web/ 。相關網頁文獻也列舉了各個腫瘤克隆進化軟件分析時所使用的原理與條件，不再詳述。 （2）CNVa. 原理CNV算法利用BAF和logR是否發生改變將基因組分割成拷貝數一致的區間。LogR受到像GC含量和復制時間的局部影響，但是BAF不會受到該影響。CNV calling算法假設大部分CNV事件是克隆性的。說明BAF和logR是由整體拷貝數產生的。該假設在大部分案例中是滿足的。 區域分割是CNV構建克隆結構重要的一步，它定義了每個一致性拷貝數的區域的邊界。不同的分割方法導致重構的差異，一些方法采用迭代連接固定大小的片段，另一種方法采用變點檢測算法。 具有整倍或者接近整倍數的CNV segments被認為是克隆性的，樣本內的所有癌細胞在某個區域具有相同的拷貝狀態。平均拷貝數與整數顯著不一致，說明存在亞克隆CNV。接下來，CNV重建克隆需要將平均拷貝數分離（整倍數變異混合物），并確定每一類的細胞比例。對于上述問題是很難解釋的：例如可能一個較大的拷貝數變化伴隨著小的細胞比例。CNV計算純度和倍性不明確也是這個原因。 對于主克隆CNV，可以要求含有主克隆CNV細胞比例相等，且與純度相等。在中等測序深度下，拷貝數估計不準確，在某個純度下，許多結果可能性相同，這對估計高拷貝區域的拷貝數也是一個典型的問題。針對亞克隆分析有以下三種方法：（1）全基因組方法將亞克隆CNV分組到相同的細胞比例克隆亞群。可以矯正單個segment錯誤，但有可能導致大規模的分組錯誤；（2）以變異事件為基礎的方法，例如Battenberg算法，利用一系列精簡原則對拷貝數segments分組。出現segment錯誤，但是僅限于segments。以上兩種方法都不能分析一個區域出現兩種以上亞克隆拷貝數狀態，它們依賴于BAF和logR輸入信息。（3）將亞克隆CNV分配到定義好的細胞比例中（例如，用SNV聚類）。以上方法都不能解決亞克隆拷貝數不清晰的問題。 b. 問題① 低有效深度腫瘤樣本檢測CNV斷點是有挑戰的。漏掉CNV斷點將導致不同拷貝數segment被認為成一個單獨segment。 ② 全基因組重復（WGD）導致CNV重構的模糊性，相當于任何CNV加倍和純度降低。CNV方法經常產生多個解決方案或者選擇有確定證據的四倍體，例如，最大或者最小拷貝數狀態為奇數。建議只用設定純度參數的方法構建克隆 數據中幾個特征可以發現純度和倍性的錯誤： 大量CNV顯示為亞克隆或者已知的早期驅動顯示為亞克隆，正確的純度可能低于目前的結果。 漏掉克隆性WGD可以通過~50% CCF判斷，50% CCF會是在WGD后的克隆性SNV，100% CCF代表突變發生在WGD前。 （3）SV此外還可以利用SV分析腫瘤樣本的克隆結構。2020年全基因組泛癌分析聯盟發表了關于單個樣本克隆結構的分析軟件Svclone，對結構變異采用注釋，計數，過濾，聚類和后續分配五步驟分析克隆結構。首先確定SV的方向和類型，計算SV的VAF；去除低質量的SV，推斷斷點的背景拷貝數；再對SV進行聚類和分配。 多個個體（每個個體多樣本）進化分析以上內容介紹了單個病人多樣本取樣分析克隆進化。除此之外，現有研究還針對多個個體（每個個體取多個樣本）進行進化趨勢或者早晚期突變分析。例如：2021年，Nature communications 期刊發表關于胸膜瘤的腫瘤進化分析。利用REVOLVER軟件將21個病人（每個病人多樣本取樣）進化結果聚類為5類不同的進化軌跡。利用系統發育構建的鴿巢原理和求和規則，通過transfer-learning實現最大似然方法擬合和識別病人間相似的進化軌跡。計算擬合軌跡之間的進化距離，將相似的進化軌跡的病人分為同一個亞組。（該方法適用于多位置取樣，不能用于時序取樣） 2017年新英格蘭期刊發表關于大規模肺癌人群的腫瘤進化譜系。對每個個體進行克隆結構分析，將多個樣本的克隆結構結果篩選并構建系統發育關系。利用deconstructSigs分析突變特征，至少有15個突變（主亞克隆）才進行突變特征分析。 2020年，泛癌分析聯盟在Nature發表關于驅動突變早期或晚期出現的特征，從整體癌癥類型揭示某癌癥人群的進化特征。針對單個樣本分析somatic mutations和拷貝數出現的先后順序，再在群體樣本分析兩個事件共發生的概率，利用聯合模型分析事件時間順序。在這個過程中得到該事件在某群體出現時序。 樣本之間的系統發育關系在閱讀文獻時，發現有些研究沒有做腫瘤克隆進化分析，也會展示一些進化樹圖片。這些進化樹圖主要闡述的是樣本之間的遠近分析。也是針對單個個體多樣本采用，然后在樣本之間篩選共有特有突變，揭示樣本遠近關系。進化樹上每個分支終點為不同樣本。這樣的分析可以采用基因組數據、DNA甲基化數據或者轉錄組數據實現。以下是針對每種數據類型分析方法原理的例子，不限于僅用以下描述的方法才能分析。 （1）基因組數據a. SNVPHYLIP軟件Wanger parsimony方法分析樣本進化，利用枝干突變代表所有腫瘤共享突變。分支突變是一個以上腫瘤樣本共有（非所有樣本），葉突變是單個樣本特有的突變。枝干長度與突變數量成正比。 一個病人所有腫瘤樣本WES測到所有突變構建系統發育關系 b. CNV利用最大簡約法建立系統發育樹，用相對拷貝數沒有變化的區域作為樹根，利用R包 phangorn 計算樹干長度。利用1000次自展法評估進化樹。 （2）DNA甲基化數據Somatic 甲基化變化，指和正常樣本比改變大于0.2。在肝癌中定義表觀驅動基因，只有高甲基化的表觀驅動基因用來構建表觀發育樹。用歐式距離計算基因組和表觀組的距離。利用neighbor-joining方法構建基因系統發育和表觀系統發育樹，利用自舉法評估每個枝干的可靠性。利用Pearson相關系數計算基因組和表觀組距離的相關相關性。 （3）轉錄組數據2021年，CANCER DISCOVERY期刊發表關于肺腺癌的研究，其中利用轉錄組數據揭示肺癌樣本不同病理位置的基因表達和免疫浸潤的變化。對每個病人的腫瘤樣本染色劃分4個不同的病理區域。檢測每個區域基因表達水平和變化，繪制不同區域連續轉錄組水平變動。 Tips純度ABSOLUTE樣本中癌細胞占比α（單基因組），正常細胞占比 (1-α)；對于位點x，q (x)為該位點在癌癥細胞的整數拷貝數；τ 為癌細胞的平均倍性，是全基因組q (x) 的平均值。樣本中，位點x的平均拷貝數為α q(x) + 2(1-α)，樣本平均倍性（D）為ατ + 2(1-α)。因此，位點x的相對拷貝數為 Absolute 軟件評估可能的相對拷貝數到整數拷貝數，不斷優化α和τ 參考文獻[1] Tarabichi M, Salcedo A, Deshwar AG, Ni Leathlobhair M, Wintersinger J, Wedge DC, Van Loo P, Morris QD, Boutros PC. A practical guide to cancer subclonal reconstruction from DNA sequencing. Nat Methods. 2021, 18(2):144-155 [2] Deshwar AG, Vembu S, Yung CK, Jang GH, Stein L, Morris Q. PhyloWGS: reconstructing subclonal composition and evolution from whole-genome sequencing of tumors. Genome Biol. 2015 Feb 13;16(1):35. [3] Jamal-Hanjani M, Wilson GA, McGranahan N, et al. Tracking the Evolution of Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 2017, 376(22):2109-2121. [4] Zhang M, Luo JL, Sun Q, et al. Clonal architecture in mesothelioma is prognostic and shapes the tumour microenvironment. Nat Commun. 2021. 12(1):1751. [5] Gerstung M, Jolly C, Leshchiner I, et al. The evolutionary history of 2,658 cancers. Nature. 2020 , 578(7793):122-128. [6] Wei Q, Ye Z, Zhong X, et al. Multiregion whole-exome sequencing of matched primary and metastatic tumors revealed genomic heterogeneity and suggested polyclonal seeding in colorectal cancer metastasis. Ann Oncol. 2017, 28(9):2135-2141 [7] Zhang J, Fujimoto J, Zhang J, Wedge DC, Song X, Zhang J, Seth S, Chow CW, Cao Y, Gumbs C, Gold KA, Kalhor N, Little L, Mahadeshwar H, Moran C, Protopopov A, Sun H, Tang J, Wu X, Ye Y, William WN, Lee JJ, Heymach JV, Hong WK, Swisher S, Wistuba II, Futreal PA. Intratumor heterogeneity in localized lung adenocarcinomas delineated by multiregion sequencing. Science. 2014, 346(6206):256-259 [8] Baker AM, Cross W, Curtius K, et al. Evolutionary history of human colitis-associated colorectal cancer. Gut. 2019, 68(6):985-995. [9] Ding X, He M, Chan AWH, Song QX, Sze SC, Chen H, Man MKH, Man K, Chan SL, Lai PBS, Wang X, Wong N. Genomic and Epigenomic Features of Primary and Recurrent Hepatocellular Carcinomas. Gastroenterology. 2019, 157(6):1630-1645 [10] Tavernari D, Battistello E, Dheilly E, et al. Nongenetic Evolution Drives Lung Adenocarcinoma Spatial Heterogeneity and Progression. Cancer Discov. 2021, 11(6):1490-1507. 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圖1 多位置取樣能更準確構建克隆結構[1]
d為測序深度；ρ 是腫瘤純度；ψ 是腫瘤樣本平均倍性 ψ = ρψT + (1 – ρ)ψN,ψT 是腫瘤倍性；ψN = 2 是正常細胞倍性。通常somatic SNV支持reads數少于3這不鑒定為somatic SNV。
圖2 PhyloWGS辨別不同克隆結構類型 Deshwar AG, Vembu S, Yung CK, Jang GH, Stein L, Morris Q. PhyloWGS: reconstructing subclonal composition and evolution from whole-genome sequencing of tumors. Genome Biol. 2015 Feb 13;16(1):35.
圖3 PyClone 分析克隆結構 Roth A, Khattra J, Yap D, Wan A, Laks E, Biele J, Ha G, Aparicio S, Bouchard-C?té A, Shah SP. PyClone: statistical inference of clonal population structure in cancer. Nat Methods. 2014 Apr;11(4):396-398
TrAp：https://tinyheero./2015/08/26/TrAp.html TrAp不具有聚類功能。僅進行進化樹構建。強簡約性：由于腫瘤進化，有一小部分亞克隆仍舊存在于腫瘤中，然而VAF值可能是殘缺的。選擇最大的殘存的VAF cluster或者選擇最大的分支點，使該親代克隆的比例為0。TrAp使用該方法判斷模糊的克隆進化關系。Strino F, Parisi F, Micsinai M, Kluger Y. TrAp: a tree approach for fingerprinting subclonal tumor composition. Nucleic Acids Res. 2013, 41(17):e165.
Malikic S, McPherson AW, Donmez N, Sahinalp CS. Clonality inference in multiple tumor samples using phylogeny. Bioinformatics. 2015, 31(9):1349-1356.
圖6 ClonEvol 克隆進化 Dang HX, White BS, Foltz SM, Miller CA, Luo J, Fields RC, Maher CA. ClonEvol: clonal ordering and visualization in cancer sequencing. Ann Oncol. 2017, 28(12): 3076-3082.
