全球9家巨頭——免疫分析儀檢測原理及必看的檢測技術！

各種現代化免疫分析儀都使用一種或兩種新的免疫分析技術,如:酶聯免疫分析技術、生物素一親和素技術、化學發光分析技術、熒光偏振技術、時間分辨熒光免疫測定技術、電化學發光技術等,使免疫檢驗手段更先進、方法更可靠、結果更準確、可與放射免疫分析技術相媲美。下面就國內外常見的幾種自動化免疫分析儀及其分析原理作一介紹。

一. 美國雅培公司的AXSYM全自動快速免疫分析系統

該系統綜合使用了微粒子捕捉酶免疫分析技術(MEIA)、熒光偏振免疫分析技術(F凹的,可測定激素、腫瘤標志物、肝炎、病毒標志物、娃娛、維生素和各種治療藥物濃度等。

(一)微粒子捕捉酶免疫分析技術(MEIA)原理。

以雙抗體夾心法為例,介紹如下:已包被了抗體的塑料微珠試劑中,加入待測標本后,經溫育,再加入堿性磷酸酶標記的抗體、形成抗體一抗原一酶標記抗體復合物。然后將其轉移到玻璃纖維柱上,用緩沖液洗滌,沒有結合的抗原、酶標抗體被洗掉,結合抗原抗體的塑料微珠則被保留在纖維柱濾膜的上方。這時再加入底物,4-甲基傘型酣磷酸鹽(4-Mup)。酶標抗體上的堿性磷酸酶將4Mup分解,脫磷酸后形成甲基傘型酣(4Mu),它在365nm激發光的照射下,發出448nm的熒光,經過熒光讀數儀的記錄、放大,計算出所測物質的含量。

(二)熒光偏振免疫分析技術(FPIA〉

這是一種均相熒光免疫分析法,主要用于測定小分子量物質,如藥物濃度測定。原理是:標記在小分子抗原上的熒光素經485m的激發偏振光照射后,吸收光能,越入激發狀態,激發狀態的熒光素不穩定,很快以發出光子的形式釋放能量而還原。發射出的光子經過偏振儀形成525一550nm的偏振光,這一偏振光的強度與熒光素受激發時分子轉動的速度呈反比,游離的熒光素標記抗原,分子小,轉動速度快,激發后發射的光子散向四面八方,因此通向偏振儀的光信號很弱,而與抗體大分子結合的熒光素標記抗原,因分子大,分子的轉動慢,激發后產生的熒光比較集中,因此偏振光信號比未結合時強得多。在測定過程中待測抗原小分子、熒光標記抗原小分子和特異性抗體大分子同時加入到一反應杯中,經過溫育,待測抗原和熒光標記抗原競爭性地與抗體結合。待測抗原越少,與抗體競爭結合的量越少,而熒光標記抗原與抗體結合量就越多,當激發光照射時,熒光偏振的程度與熒光標記物分子轉動的速度成反比,而熒光標記的小分子抗原與大分子抗體結合后,其分子的轉動速度減慢,因此熒光偏振信號強。結果是待測抗原的濃度低,可以通過計算獲得其含量。

二. 美國拜耳公司ACS:180SE和ACS:CENTAUR全自動化學發光免疫分析系統

該系統是利用化學發光技術和磁性微粒子分離技術相結合的測定方法。以吖啶酶為發光的標記物,固相載體為極細小的磁性顆粒。其測定原理與放射免疫和酶聯免疫中的雙抗體夾心法和競爭結合法相似。下面以雙抗體夾心法為例進行介紹。

(一) 單克隆抗體包被磁性微粒:磁性微粒是以三氧化二鐵為核心,外包一薄層聚苯乙烯組成,直徑10-2OL由于磁性微粒體積小,幾千萬顆微粒的表面積比等量的固相載體表面積大得多,可吸附更多的抗體,同時磁性微粒的核心是鐵,在磁場中很快下沉,因此容易進行洗滌和分離。

(二) 抗原抗體結合:包被了單克隆抗體的磁性微粒中加入一定量的標本后,標本中的抗原與微粒上的抗體結合,再加上吖啶酶標記的多克隆抗體,經過溫育形成固相包被抗體－抗原－吖啶酶標記抗體復合物。

(三) 洗滌、分離:在電磁場中進行3~5次洗滌后,很快將未結合的多余抗原和標記抗體洗去。

(四) 加入氧化劑發光:經過洗滌的磁性微粒中,加入氧化劑(H202)和pH糾正液(NaOH)使成堿性,這時吖啶酶在不需要催化劑的情況下分解、發光,由集光器和光電倍增管接收。記錄5秒鐘內所產生的光子能,這部分光的積分與被測抗原的量成正比,可從標準曲線上計算出待測抗原的含量。

三. 美國強生公司的Vitros ECi全自動增強化學發光酶免分析儀系統

該系統由Arnerlite發展而來,采用酶聯免疫技術、生物素親和素技術和增強化學發光技術。它是用辣根過氧化物酶(HRP)標記抗原或抗體、以子彈頭型塑料小孔管為固相載體,魯米諾為化學發光劑,并加入化學發光增強劑,可使化學發光強度增強、時間延長而且穩定。下面簡單介紹其工作原理。

(一)在鏈霉親和素包被的子彈頭型塑料小孔管中,加入生物素標記的特異性抗體和待測標本,經過37℃溫育,鏈霉親和素與生物素結合,特異性抗體與標本中的抗原結合,形成鏈霉親和素一生物素一抗體一抗原復合物,經過洗滌,將多余的標本和生物素標記抗體除去。

(二) 加入辣根過氧化物酶標記抗體,經37℃溫育,形成鏈霉親和素一生物素一抗體一抗原一酶標抗體復合物,并固定在小孔管壁上。

(三) 加入氧化劑H202，增強化學發光劑和魯米諾,這時結合在固相載體上的辣根過氧化物酶在強氧化劑的作用下將增強化學發光劑亞鐵原吟琳激活,接著它催化并激活魯米諾發光,這種化學發光強渡比單獨魯米諾發光強,持續時間長,而且穩定,易于測定。

(四) 魯米諾發光強度經光量子記錄系統記錄,經計算'從標準曲線上得出待測抗原含量。

四. 法國梅里埃公司的VIDAS全自動熒光酶標免疫測試系統

該系統以堿性磷酸酶標記抗原或抗體,用塑料吸管(SPR)為固相載體,以4-甲基傘型酬磷酸鹽(4-MIjP)為發光劑,其測定原理及過程以雙抗體夾心法描述如下:

(一) 將待測標本加入多孔試劑條的樣本孔內,然后將多孔試劑條插入儀器內。

(二) 將單克隆抗體包被的塑料吸嘴SRP(其形態與加樣器的吸頭相似),插入多孔試劑條的上方。

(三) 儀器自動將待測樣本來回多次吸入塑料吸嘴,以促抗原抗體反應,經溫育后吸入緩沖液進行洗滌。

(四) 然后來回多次吸入堿性磷酸酶標記抗體,使塑料吸嘴內表面形成包被抗體一抗原一酶標抗體復合物,經溫育后進行洗滌。

(五) 最后加入底物4-甲基傘型酣磷酸鹽,它被酶標抗體上的堿性磷酸酶分解,脫磷酸形成4-甲基傘型酣,經370nm激光照射下,發出450nm的熒光,經熒光讀數儀記錄,并計算出所測物質的含量

五. 美國貝克曼公司(Beclunarl)的Access全自動微粒子酶放大化學發光免疫分析系統

是由美國貝克曼公司和法國巴斯德研究院合作設計生產的。該系統以堿性磷酸酶標記抗原或抗體、以磁性微粒子為固相載體,用AMPPD(Diomums)作為化學發光劑,這種化學發光劑發光穩定、持續時間長,因此比閃爍發光容易控制。其測定原理和過程簡述如下:

(一) 單克隆抗體包被磁性微粒L微粒直徑<7μ(其余同ACS:180)。

(二) 抗原抗體結合:包被單克隆抗體的磁性微粒中加入標本后,標本中的抗原與微粒表面的抗體結合,再加入堿性磷酸酶標記的抗體,經溫育后形成固相包被抗體-抗原-酶標記抗體復合物。

(三) 洗滌、分離:同ACS:180

(四) 加入底物AMPPD發光劑:AMPPD在酶標記抗體上的堿性磷酸酶催化作用下,迅速去磷酸,生成不穩定的中介體AMPD。AMPD很快分解,從高能激發態,回到低能量的穩定態,同時發射出光子,這種化學發光持續而穩定,可達數小時之久。通過光量子閱讀系統記錄發光強度,并從標準曲線上計算出待測抗原的濃度。

六.美國DPC公司(Diagnostic products corporation)的I刷ULITE2000型全自動酶放大化學發光免疫分析系統

該系統以堿性磷酸酶標記抗原或抗體,用Dioxetarl作為發光物質,以塑料珠為固相載體。測定原理與貝克曼公司的Access基本相同。

發光物質Dioxetane phosphate的分子結構中有兩個重要部分:一個是聯接苯環和金剛炕的二氧四節環,它可以斷裂并發射光子:另一個是磷酸基團,它維持著整個分子結構的穩定。當有堿性磷酸酶存在時,這種發光物質作為酶的底物,在酶催化下脫去磷酸根的基團,形成一個不穩定的中間體。這個中間體隨即自行分解(二氧四節環斷裂〉,同時發射光子。這種發光物質發射的光穩定,持續時間長。發光的強度與堿性磷酸酶的量成正比,因此可計算出標本中待測物質的濃度。

七. 美國EG&G Wallac公司的auto DELFIA全自動時間分辨熒光免疫檢測系統

該系統用制系元素標記抗原或抗體作為示蹤物,并與時間分辨熒光測定技術(TRFIA)相結合,建立了一種新的非放射性微量分析技術,具有靈敏度高,示蹤物發光穩定,不受樣品自然熒光干擾,標準曲線范圍寬,檢測重復性好等優點。

(一)制系元素熒光光譜的特點:

通常熒光光譜分兩部分,激發光譜和發射光譜。普通物質產生的熒光光譜Stokes位移較小,因此激發光譜和發射光譜常有重疊,互相干擾。而常見的游離鍋系元素熒光信號也很弱,但當它與有機配合體結合后,分子內和分子間能量傳遞,使熒光強度明顯增強,而且稀土離子(包括制系元素)的熒光光譜有較大的Stokes位移(約290nm),使激發光譜和發射光譜不會互相重疊。另外稀土離子發射光譜的峰相當窄,特異性很強,熒光壽命長,比普通熒光高出幾個數量級,因此可以采用延緩測量時間的方式來降低樣品和試劑的本底熒光干擾,提高了測定的精密度。

(二)時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)原理:

時間分辨熒光免疫分析法使用的示蹤物是三價稀土離子如:銪(Eu3+)、釤(Sm3+)、鏑(Dy3+)和鋱(Tb3+)等,它們可利用具有雙功能基團結構的整合劑,在水溶液中與抗原分子以共軛雙鍵結合,形成稀土離子－整合劑-抗原結合物。當標記稀土離子的抗原與待測抗原共同與抗體競爭結合,形成抗原抗體免疫復合物,其中含有標記的稀土離子,然后利用時間分辨熒光分析儀,可測出復合物中稀土離子發射熒光的強度,以此確定待測抗原的含量,也即固相競爭法。時間分辨免疫熒光分析法(TRIm)的原理是將稀土離子通過整合劑與抗體分子上的游離氨基共價結合,形成稀土離子－整合劑－抗體結合物,用于建立雙抗體夾心免疫分析法。

八.瑞士羅氏公司ES300型全自動酶免分析儀。

該儀器系用酶聯免疫分析技術,生物素一親和素技術,以鏈霉親和素包被的塑料管為固相載體,顯色劑底物是ABTS。其測定原理和過程(以兩步夾心法為例)簡述如下。

(一) 將鏈霉親和素包被的聚苯乙烯塑料試管置于儀器內。

(二) 將生物素標記的特異性抗體和待測抗原力日入鏈霉親和素包被試管內,經溫育,生物素和親和素發生連接,待測抗原與特異性抗體發生結合,形成了固相包被親和素一生物素一特異性抗體一待測抗原復合物,然后進行洗滌,去除未結合的抗原和生物素標記抗體。

(三) 加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的特異性抗體(酶標抗體)經溫育形成固相包被鏈霉親和素－生物素－特異性抗體－待測抗原－酶標抗體復合物,再次進行洗滌,除去多余的酶標抗體。

(四) 加入底物ABTS和H202，經溫育,ABTS在辣根過氧化物酶的作用下,氧化呈現藍色,然后吸入流動比色杯,經422nm的酶標儀測定獲得OD值,經計算可得出待測抗原的含量。

九.瑞士羅氏公司ELECSYS 1010和ELECSYS2010型全自動電化學發光免疫分析系統

該系統采用世界上最先進的電化學發光技術,生物素一親和素技術,并以磁性微粒為固相載體。電化學發光免疫測定(ECLIA)是繼放射免疫、酶聯免疫、熒光免疫、化學發光免疫以后的新一代標記免疫測定技術,是電化學發光和免疫測定相結合的產物。電化學發光標記物發光的原理與一般化學發光不同,是一種在電極表面由電化學引發的特異性化學發光反應。它包括電化學和化學發光兩個過程。ECLIA的優點是靈敏度高,測定速度快、線性范圍寬、結果穩定、自動化程度高、試劑保存期長,應用范圍廣等。

(一)電化學發光反應原理:

化學發光劑三聯吡啶釕[Ru (bpy)3]+和電子供體三丙胺(TPA)在陽電極表面可同時失去一個電子而發生氧化反應。二價的[Ru (bpy)3]2+被氧化成三價,這是一種強氧化劑。TPA失去電子后被氧化成陽離子自由基TPA+·,它很不穩定,可自發地失去一個質子(H+),形成自由基TPA·,這是一種很強的還原劑,可將一個電子給蘭價的[Ru (bpy)J+使其形成激發態的[Ru(bpy)3]2+·。激發態的三聯吡啶釕很快發射出一個波長620nm的光子,回復成基態的三聯吡啶釕。這一過程可以在電極表面周而復始地進行,產生許多光子,使光信號增強。

(二)電化學發光反應模式(以雙抗體夾心法為例):

1.首先將特異性抗體包被在磁性微珠上。另外將發光劑[Ru(bpy)3]2+標記在特異性抗體上。

2.將待測樣本與包被抗體的磁性微珠和發光劑標記的抗體共同溫育,形成磁性微珠包被抗體-抗原-發光劑標記抗體復合物。

3.將上述復合物吸入流動室,同時加入TPA緩沖液。當磁性顆粒復合物流經電極表面時,被安裝在電極下面的磁鐵吸引,使[Ru(bpy)3]2+和TPA在電極表面進行電子轉移,產生電化學發光。光的強度與待測抗原的濃度成正比。

4.這一反應模式中還可引入生物素－親和素技術,使靈敏度更高。