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4.1．酶免疫分析儀
4.1.1酶免疫分析技術的分類 酶免疫分析(enzyme immunoassay，EIA) 是目前臨床應用最多的一類免疫分析技術，可分為非均相(或異相)酶免疫測定和均相酶免疫測定兩種方法。 均相酶免疫分析法（homogeneous enzyme immunoassay，HEI） 均相酶免疫分析主要有酶擴大免疫測定技術和克隆酶供體免疫測定兩種方法。 非均相酶免疫分析法（heterogeneous enzyme immunoassay） 常用的酶免疫分析法多為非均相法，又可分為液相酶免疫法和固相酶免疫法兩種，以后者最常用，稱為酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。ELISA是臨床上最常用的免疫分析方法，目前常用的酶免疫分析儀都是基于ELISA技術，稱為酶免疫分析儀。 4.1.2酶免疫分析儀的類型、工作原理及基本結構 根據儀器結構和自動化程度, 針對固相支持物的不同（如微孔板、試管、小珠、磁微粒等）作為吸附免疫試劑的載體，因而設計成不同的酶免疫分析儀，其基本工作原理就是分光光度法，在光電比色計或分光光度計的基礎上根據ELISA技術的特點而設計。包括： 微孔板固相酶免疫測定儀器 國際上微孔板式ELISA使用的載體為96孔板，采用直接對微板孔測定吸光度（A）的比色計。 (1) 酶標儀 酶標儀也稱為ELISA測讀儀（ELISA reader）,有單通道和多通道兩種類型。自動型多通道酶標儀有多個光束和多個光電檢測器，檢測速度快。如8通道的儀器，設有8條光束（或8個光源）、8個檢測器和8個放大器。多通道酶標儀的檢測速度較快。 酶標儀的工作原理與主要結構和光電比色計幾乎完全相同（見圖16-1）。既可以使用和分光光度計相同的單色器，也可以使用干涉濾光片來獲單色光，此時將濾光片置于微孔板的前、后的效果是一樣的。
酶標儀的工作原理和光路與普通光電比色計的不同之處在于（見圖16-2） ：比色液的容器不是比色皿，而是用塑料微孔板；酶標儀以垂直光束通過微孔板中的待測液；酶標儀通常使用光密度OD來表示吸光度。現在大部分的酶標儀還加上了判讀系統和軟件操作分析系統等。
圖16-2 酶標儀光路系統簡圖 (2) 半自動微孔板式ELISA分析儀 半自動微孔板式ELISA分析儀在酶標儀的基礎上再配置加液器、溫育器、洗板機和測讀儀等分別組成。測定中需由手工將微孔板移至下一步驟的儀器中進行。洗板機要求洗滌后固相表面非特異性物質洗滌干凈，吸液后每孔中殘留的液量極小。較精密的洗板機有可調節的定時、洗滌液定量及振蕩微孔板的功能。 (3) 全自動微孔板式ELISA分析儀 自動化酶免疫分析系統由加樣系統、溫育系統、洗板系統、判讀系統、機械臂系統、液路動力系統、軟件控制系統等組成，這些系統既獨立又緊密聯系。全自動微孔板式ELISA分析儀用在大批量標本的檢測中，不但提高了工作效率，而且測定的精密度亦得到改善。微孔板式ELISA儀器均為開放式的，即適用于所有微板式ELISA試劑。ELISA檢測結果的精密度主要取決于試劑的質量。全自動ELISA儀器本身的精密度一般在3%左右。應用優質試劑測定結果的精密度，定量測定可達到7%以下；常用的定性測定為感染性疾病抗原、抗體的檢測，精密度在10%左右。 （4）管式固相酶免疫測定儀 應用管式固相載體的ELISA分析儀器不多，在我國應用的有： ① 1990年德國推出的全自動管式ELISA分析系統和配套試劑。試劑包括用鏈霉親和素包被的聚苯乙烯管、生物素結合的抗原或抗體，辣根過氧化物酶標記的抗體和顯色底物ABTS。測定中標準曲線可使用2星期，每次測定只需一點定標。測定的精密度CV在3%左右。測定項目齊全，包括激素、腫瘤標志、心肌標志和感染性疾病的抗原、抗體等。② 法國生產的是一種特殊形狀的管式全自動ELISA的分析儀，配套使用一個特別的“試劑條”（reagent strip）。 （5）微粒固相酶免疫測定儀 美國生產自動酶免疫分析儀應用聚苯乙烯微粒（顆粒直徑0.47μm）作為固相，特異抗體或抗原包被在微粒上。第一次抗原抗體反應后，將反應液通過特制的玻璃纖維膜，聚苯乙烯微粒吸附在玻璃纖維膜上，液體則通過膜濾出。以后的反應在膜上進行，用過濾方式洗滌。標記酶為堿性磷酸酶，底物為4-甲基傘酮磷酸酶，反應后進行熒光測定。其后生產的作藥物測定的熒光偏振分析儀與一體多項目全自動免疫分析儀也在檢驗實驗室廣泛應用。 （6）磁微粒固相酶免疫測定儀 磁微粒可用磁鐵吸引與液相分離，是免疫測定中較為理想的固相載體，較早應用磁微粒作為酶免疫測定固相的是瑞士出品的分析系統，由分光光度測讀儀、磁鐵板和試劑3部分組成。試劑包括抗異硫氰酸熒光素（FITC）抗體，特異抗體或抗原包被的磁微粒（顆粒直徑1μm），FITC結合的特異抗體或抗原，堿性磷酸酶標記的特異抗體或抗原及底物酚肽（phenolphthalein）磷酸酯。其應用的抗FITC-抗體是與親和素-生物素原理相同的間接包被系統，反應模式與電化學發光免疫測定亦相似。反應在試管中進行，基本上用手工操作。反應結束后將試管架放在磁鐵板上，磁微粒被磁鐵吸引至管底，完成固相與液相的分離。酶作用后反應液呈粉紅色。 4.1.3 酶免疫分析儀的性能評價和維護保養 評價指標和方法 （1）濾光片波長精度檢查及其峰值測定 （2）靈敏度和準確度 靈敏度 準確度 （3）通道差與孔間差檢測 通道差檢測 孔間差的測量 （4）零點飄移 （5）精密度評價 （6）線性測定 （7）雙波長評價 （8）全自動酶免分析儀的主要技術參數應達到如下要求： 可隨機安排項目檢測，每板上可同時做8個相同條件的項目檢測。可用加樣針或Tip頭加樣；加樣速度應>700個／h；加樣體積為：用針時2μl~300μl，用Tip頭時10μl ~300μl，精度均為1μl可調；加樣精度為：用針時CV<1％，用Tip頭時CV<2％。試劑加樣速度應2800孔／h；加樣體積2μl~300μl ，精度為lμl 可調；加樣精度為100μl 時，CV<2％。有液面感應裝置。標本架為可移動架，可同時放置92管標本。標本架中心為12個可移動的試劑架，并有8個稀釋液架。有標本識別的條碼閱讀器，溫育系統有可控溫在200C ~400C的平臺加熱器，溫度設置誤差在±0.50C內，有>4個加熱孵育板位，軌道式振蕩，每個板位獨立控溫，互不干擾。洗板機液殘量控制在2μl 以內。濾光片吸光度范圍為0~3.0D。 酶免疫分析儀的維護 酶免疫分析儀維護的重點是在光學部分，防止濾光片霉變。應定期檢測校正，保持其良好的工作性能。 4.1.4 酶免疫分析儀的臨床應用 1.病原體及其抗體的檢測 2.各種免疫球蛋白和細胞因子、補體等 3.腫瘤標志物 4.多種激素 5.藥物和毒品 4.2發光免疫分析儀 發光免疫技術根據示蹤物檢測的不同而分為熒光免疫測定、化學發光免疫測定及電化學發光免疫測定三大類。化學發光免疫根據標記物的不同，有化學發光免疫分析、微粒子化學發光免疫分析、電化學發光免疫分析、化學發光酶免疫分析和生物發光免疫分析等分析方法。現臨床以前三者較為常用。本節主要介紹目前國內臨床應用較多的化學發光免疫分析儀和電化學發光免疫分析儀。 4.2.1發光免疫分析的種類和基本原理 4.2.1.1 發光免疫分析的基本種類 根據標記物的不同有下列幾種分析方法： 1．化學發光免疫分析 其標記物為氨基酰肼類及其衍生物如5—氫基鄰苯二甲酰肼(魯米諾)等。 2．化學發光酶免疫分析 先用辣根過氧化物酶標記抗原或抗體，在反應終點時再用魯米諾測定發光強度。 3．微粒子化學發光免疫分析 其標記物為二氧乙烷磷酸酯等。 4．生物發光免疫分析 熒光素標記抗原或抗體，直接或間接參加發光反應。 5．電化學發光免疫分析 所采用的發光試劑標記物為三氯聯吡啶釘[Ru(bpy)3]2++N羥基琥珀酰胺酯。此種方法較常用。 4.2.1.2 發光免疫分析基本測定方法 根據發光反應檢測方式的不同可分為下列主要的測定方法。 1．液相法 免疫反應在液相中進行，反應后經離心或分離措施后，再進行測定發光強度。所用分離方法包括葡聚糖包被的活性炭末、SephadexG—25層析柱、第二抗體等。 2．固相法 將抗原抗體復合物結合在固相載體(如聚苯乙烯管)或分離介質上(如磁性微粒球、纖維素、聚丙烯酰胺微球等)，再進行測定發光強度，此法較常用。試驗原理與固相RIA和ELISA方法基本相同。 3．均相法 如同均相酶免疫測定一樣，在免疫反應后，不需要經過離心或分離步驟，即可直接進行發光強度檢測。其原理是某些化學發光標記物(如甾體類激素的發光標記物)與抗體或蛋白結合后，就能增強發光反應的發光強度。 4.2.2 發光免疫分析儀的種類、工作原理和基本結構 重點介紹全自動化學發光免疫分析系統、全自動微粒子化學發光免疫分析系統和全自動電化學發光免疫分析儀。 4.2.2.1 全自動化學發光免疫分析系統 全自動化學發光免疫分析系統采用化學發光技術和磁性微粒子分離技術相結合的免疫分析系統。在90年代初首次應用 后又不斷改進，將微機與主機分開，軟件程序加以改進，使操作更靈活，試劑貯存時間長，結果準確可靠，自動化程度高等優點。 1．儀器測定原理 該類分析技術有兩種方法，小分子抗原物質測定采用的是競爭法，而大分子抗原物質測定采用的是夾心法。儀器所用固相磁粉顆粒極微小，其直徑僅1.0μm。這樣大大增加了包被表面積，增加抗原或抗體的吸附量，使反應速度加快，也使清洗和分離更簡便。其反應基本過程有： (1)競爭反應 (2)夾心法 2．儀器組成 一般由主機和微機兩部分組成。 （1）主機部分：是儀器的運行反應測定部分，包括原材料配備部分、液路部分、機械傳動部分、光路檢測部分。材料配備部分包括反應杯、樣品盤、試劑盤、純凈水、清洗液、廢水在機器上的貯存和處理裝置；液路部分包括過濾器、密封圈、真空泵、管道、樣品及試劑探針等；機械傳動部分包括傳感器、運輸軌道等；電路部分包括光電倍增管和線路控制板。 （2）微機系統 是儀器的核心部分，是指揮控制中心。其功能有程控操作、自動監測、指示判斷、數據處理、故障診斷等，并配有光盤。主機還配有預留接口，可通過外部貯存器自動處理其它數據，并搖控操作，用于實驗室自動化延伸發展。 4.2.2.2 全自動微粒子化學發光免疫分析系統 全自動微粒子化學發光免疫分析系統采用微粒子化學發光技術對人體內的微量成分以及藥物濃度進行定量測定。系統具有高度的特異性、高度的敏感性和高度的穩定性等特點。 1．分析方法及過程 采用磁性微粒作為固相載體，以堿性磷酸酶作為發光劑，固相載體的應用擴大了測定的范圍。以競爭法、夾心法和抗體檢測等免疫測定方法為基礎： (1)抗原抗體結合 將包被單克隆抗體的順磁性微粒和待測標本加入反應管中，標本中的抗原與微粒子表面的抗體結合，再加入堿性磷酸酶標記的抗體，經溫育后形成固相包被抗體—抗原—酶標記抗體復合物；(2)洗滌、分離 (3)加入底物 (AMPPD)發光劑 ，AMPPD被結合在磁性粒子表面的堿性磷酸酶的催化下迅速去磷酸基因，生成不穩定的中介體AMPD，AMPD很快分解，從高能激發態回到低能量的穩定態，同時發射出光子，從標準曲線上計算出待測抗原的濃度。 2．儀器組成 一般由微電腦控制、樣品處理系統、實驗運行系統、中心供給系統和中心控制系統四部分組成。 4.2.2.3 全自動電化學發光免疫分析儀 電化學發光免疫分析技術在新一代實驗室免疫檢測技術中很有特點，它在20世紀90年代一問世就引起廣泛的關注。德國公司在鏈酶親和素—生物素包被技術基礎上，引用電化學發光免疫分析技術并開發出相應的檢測系統。 1．測定原理及過程 該類分析儀集多種技術于一身，應用了免疫學、鏈酶親合素生物包被技術及電化學發光標記技術。將待測標本與包被抗體的順磁性微粒和發光劑標記的抗體加在反應杯中共同溫育，形成磁性微珠包被抗體—抗原—發光劑標記抗體復合物。復合物吸人流動室，同時用TPA緩沖液沖洗。當磁性微粒流經電極表面時，被安裝在電極下的磁鐵吸引住，而游離的發光劑標記抗體被沖洗走。同時在電極加電壓，啟動電化學發光反應，使發光試劑標記物三氯聯吡啶釘[Ru(bpy)3]2+TPA在電極表面進行電子轉移，產生電化學發光。光的強度與待測抗原的濃度成正比。 2．儀器組成及特點 主要由樣品盤、試劑盒、溫育反應盤、電化學檢測系統及計算機控制系統組成，該類儀器特點為：①測定速度快、 ②樣品盤可放置較多標本、③試劑盤帶有內置恒溫裝置，以利于試劑保存。④全自動二維條碼識別系統⑤靈敏度高。 按照免疫學的方法原理可應用三種抗原抗體反應方法：抑制免疫法用于小分子量蛋白抗原檢測；夾心免疫法用于大分子量物質檢測和橋聯免疫法用于抗體如IgG、IgM檢測。還有釕標記用于DNA／RNA探針分析。 4.2.3 發光免疫分析儀的臨床應用 1．甲狀腺系統 檢測總T3、總T4、游離T3、游離T4、促甲狀腺素、超敏促甲狀腺素、T3攝取量等； 2．性腺系統 檢測絨毛膜促性腺激素、泌乳素、雌二醇、雌三醇、促卵泡成熟素、促黃體生成素、孕酮、睪酮等； 3．血液系統 檢測維生素B12、葉酸、鐵蛋白等； 4．腫瘤標記物 檢測甲胎蛋白、癌胚抗原、CA153、CA125、CA199、β2－微球蛋白、前列腺特異抗原、游離前列腺特異抗原等； 5．心血管系統 檢測肌紅蛋白、肌鈣蛋白、磷酸肌酶-MB等； 6．血藥濃度 檢測地高辛、苯巴比妥、苯妥英、茶堿、萬古霉素、慶大霉素、洋地黃、馬可西平等； 7．感染性疾病：檢測Anti-HAV，Anti-HAV-IgM，HBsAg，Anti-HBc，Anti-HBs，Anti-HBe，HBeAg，Anti-HCV，HIV-Ag等； 8．其他 檢測IgE、血清皮質醇、尿皮質醇、尿游離脫氧吡啶等。 4.3放射免疫分析 放射免疫技術（radio immunoassay ,RIA）類型主要包括經典的放射免疫分析(radioimmunoassay, RIA)和免疫放射分析或免疫放射度量分析( immunoradiometric assay，IRMA)。由于受接觸放射性物質，損害操作人員的身體，測定完成后放射性材料的處置等問題的存在,再加上80年代初出現的非同位素標記技術得到了極大的發展和廣泛應用，放射免疫技術的應用有下降的趨勢。 4.3.1 放射性核素的種類特點和檢測儀的基本結構與原理 4.3.1.1 放射性核素的種類和特點 放射性核素依衰變方式分α、β、γ三種，用于放射性標記的有β和γ兩類;分別用液體閃爍計數器及γ計數器測定。目前常用的是γ型放射性核素，如125I、131I、51Cr和60Co，以125I最常用；β型放射性核素有3H、14C和32P，以3H最常用。 4.3.1.2 檢測的基本結構原理、結構及其探測原理 核射線探測儀器由射線探測器和后續電子學單元兩大部分組成。核射線探測器是個能量轉化器，其檢測原理是當射線作用于閃爍體，閃爍體吸收了射線的能量而引起閃爍體中的原子或分子激發，當受激的原子或分子退激時，則發出光子進入光電倍增管光陰極，轉換為光電子，光電子在光電倍增管電場作用下到達陽極，形成電脈沖。轉換模式是放射能→光能→電能→脈沖。 液體閃爍測量是在閃爍杯內進行的，放射性樣品主要被溶劑和閃爍劑分子包圍，射線能量先被溶劑分子吸收，受激溶劑分子退激時釋放出能量激發閃爍劑，當激發態回到基態時釋放出光子到達光陰極，光陰極產生光電子，在光電倍增管的電場作用下，在陽極獲得大量電子，形成脈沖信號，輸入后讀分析電路形成數據信號，最后由計算機數據處理，求出待測抗原含量。 放射性活度測定方法 放射免疫分析中經抗原抗體反應和B、F分離后通過檢測放射性量來反映待測物的含量。放射性量的檢測需特殊的儀器，放射免疫分析儀實際上就是進行放射性量測定的儀器。測量儀器有兩類，即晶體閃爍計數儀（主要用于檢測γ射線，如125I、131I、57Cr等）和液體閃爍計數儀（主要用于檢測β射線，如3H、32P、14C等）。無論是晶體閃爍計數儀還是液體閃爍計數儀都是將射線（放射能）與閃爍體的作用轉換成光脈沖（光能），然后用光電倍增管將光脈沖轉換成電脈沖（電能），電脈沖在單位時間內出現的次數（即儀器記錄的cmp值）反映了發出射線的頻率，而電脈沖的電壓幅度則反映了射線能量的高低。 計數單位是探測器輸出的電脈沖數，單位為cpm（計數/分），也可用cps（計數/秒）表示。如果知道這個測量系統的效率，還可算出放射源的強度，即dpm（衰變/分）或dps（衰變/秒）。 4.3.2 晶體閃爍計數器組成和工作原理 晶體閃爍計數器又稱γ放射計數器，主要用于檢測如125I、131I、57Cr和60Co等產生的γ射線。 4.3.2.1 儀器組成及工作原理 （1）閃爍體 閃爍體是將核輻射能激發分子轉化成可探測閃光的熒光物質。常用的有有機閃爍體、無機閃爍體和特殊閃爍體等。 （2）光電倍增管 光電倍增管的作用是有選擇性地把閃爍體發出的極弱閃光的一部分轉換成電信號。光電倍增管的基本結構主要包括光電轉換、電子倍增和電子收集裝置三個部件。 在醫學檢驗中，用于體外樣品放射性測量的井型NaI、Tl、）閃爍探測裝置中的晶體及光電倍增管等是裝在一只有蓋的鉛室中的。由于探測效率和探頭相對于樣品的幾何位置關系十分密切，測量中要特別注意。還要避免樣品對探頭的污染，一旦造成污染，要及時進行有效的去污處理，以免使儀器本底增高，影響裝置性能指標。 （3）多道脈沖分析器 多道分析器（MCA）是進行能譜分析的重要儀器，現代的MCA與通用微型計算機有許多共同特性，是現代核探測分析及放射影像裝置的重要組成部分。 ①脈沖高度分析器的基本原理 比例放大器、甄別器和反符合電路三部分組成了典型脈沖高度分析器的主體。 由光電倍增管產生的輸出脈沖與γ射線等在NaI、Tl等閃爍體內失去的能量成正比。將此脈沖信號輸入放大器進行放大，由于輸入脈沖高度與輸出脈沖高度是按比例設計的，該放大器稱比例放大器。經比例放大的脈沖信號再被送入甄別器。由上限和下限兩個甄別器組成，分別讓脈沖高度高于下限甄別器預定電壓U的信號及高于上限甄別器預定電壓U+△U的信號送入反符合電路。反符合電路有選通特性，輸入脈沖只有一路進入時，便輸出一個脈沖，否則電路無脈沖輸出。于是整個電路只選取了脈沖高度在U和U+△U的信號進行計數。如果設定△U值，逐漸變換U并讀出計數值，便可獲得γ射線在晶體內所失出的能量分布狀態，即能譜。其中U稱閾電壓，△U稱窗電壓或窗寬。 ②多道分析器（MCA） 多道分析器的基本組成部分是模-數變換器（ADC）和存儲器。每個存儲單元都是一個獨立的計數器。進入分析器的所有脈沖按多路定標方式以幅度大小安排在各個存儲單元中計數，直到全部存儲器都被尋址為止。這種工作方式的凈效應就是提供和分析器道數相等數量的一些獨立的計數器進行脈沖高度分析計數，各計數器再把每一順序時間間隔內的總計數記錄下來，完成多路定標的脈沖高度多道分析。 ③γ能譜分析 γ射線可以通過光電吸收、康普頓散射、電子對產生三種機制與物質發生作用。NaI、Tl等閃爍體可以將作用時損失的能量在能譜儀中記錄下來。能譜的橫坐標為脈沖高度，縱坐標為一定時間內所測到的各個脈沖高度（在一定寬度范圍內）的頻數。能譜中高峰部位是由光電吸收而形成的光電峰，又稱全能峰，是放射性核素的標識峰。能譜中占份額較大的是康普頓坪。高能γ射線還會形成電子對產生的逃逸峰。峰的面積和γ射線的強度成正比，γ能譜分析就是根據能譜中各標識峰面積的相對比例來測定樣品中放射性的組成，因此根據峰的位置和面積可對放射性核素進行定性和定量分析。 4.3.2.2 γ-輻射計數器 （1）工作原理 γ輻射計數器主要用于125I、131I等以及能量在400KeV以下γ或X放射線的探測。 γ-輻射計數器以NaI，并摻入少量的鉈（Tl）晶體為探測元件。使用鉈激活的晶體對γ輻射的吸收高，熒光產額高，時間分辨能力強。當樣品位于晶體井內時，晶體吸收125I釋放的γ射線能量后，使閃爍晶體處于受激狀態，受激的原子或分子在退激過程中將以閃光形式釋放能量。晶體發出這一短暫的閃光稱為光脈沖。光脈沖照射到光電倍增管的光陰極，打擊出光電子，再經打拿極逐級放大，最后在光電倍增管的陽極獲得電脈沖。 （2）系統組成 整機可分作采樣部分和數據處理部分。采樣部分由探頭、換樣裝置、高低壓電源、放大器及單道組成。數據處理部分由接口、計算機、輸入輸出裝置等組成。 （3）使用中應注意的問題 ①γ儀的機器效率一般用125I標準源（其放射性活度（用dpm為單位表示）由儀器制造廠提供）。放到測量井記下cpm值后算出的效率（效率=cpm/dpm）乘上1.25倍就得125I的效率,其效率一般應大于70％。若不到70％，首先微調高壓到計數最大值，如仍達不到，則應對儀器作檢查；②要防止探頭部分的NaI晶體碰壞，晶體受潮后會發黃使效率下降。 4.3.3液體閃爍計數器基本結構和應用 液體閃爍計數器是醫學研究中常用的一種放射性測定儀器，多用于蛋白質(如細胞因子、激素等)對細胞增殖分化的影響或分泌表達蛋白質能力的研究。由于它是將樣品混入閃爍體溶液內的，不存在樣品中的射線自吸收，并可進行4π立體角的測量，成為3H、14C等低能β射線及α射線的最適宜的輻射探測裝置。 4.3.3.1液體閃爍計數器的基本結構 液體閃爍計數器的結構和性能不斷發展，目前多采用雙管快符合對稱系統多獨立道分析，與微機聯用，實現了高度的自動化。 （1）基本電子線路 液體閃爍計數器的電路圖主要由雙管快符合、相加電路、線性門電路及多道脈沖幅度分析器等組成。 （2）自動換樣器 自動換樣器的使用不僅節省時間，還可使樣品有足夠的暗適應和溫度平衡時間。樣品傳送機構類型較多，一般使用繼電器控制的傳送帶、升降機、輪盤等。為了做到可靠的光密封，測量位置通道口設有快門、迷宮和轉輪等。有的自動換樣控制器還具備一定的識別功能，適應多用戶需要。 （3）微機操作系統 多數儀器都可用微機進行工作條件選定、各種參數的校正、讀取數據等操作。由于多采用鍵盤操作，并伴有顯示屏指令提示，操作容易掌握。 4.3.3.2液體閃爍計數器的使用 （1）樣品-閃爍液反應體系建立 樣品和閃爍液按一定比例裝入測量瓶，向光電倍增管提供光信號。 （2）猝滅 樣品、氧氣、水及色素物質等加入閃爍體中，會使閃爍體的熒光效率降低，出射熒光光譜改變，從而使整個測量裝置的測量效率降低的過程稱為猝滅。為減小猝滅，可在閃爍液中通氮氣或氬氣驅氧；將樣品pH值調至7左右，避免酸的猝滅作用；對卟啉、血紅蛋白等著色樣品進行脫色處理等。 （3）計數效率測定 液體閃爍計數器通常用于放射性的相對測量，即通過樣品的計數率與標準樣品的計數率的比較來測定樣品。由于標準樣品與待測樣品的猝滅情況不同，就需要對猝滅進行必要的校正來求出每個具體樣品相對于標準樣品的實際計數效率。常用的校正法有內源法，外源法和道比法等。目前廣泛使用的是外部標準源校正法。 4.3.4 放射免疫分析儀的應用 放射免疫分析由于敏感度高、特異性強、精密度高、可測定小分子和大分子物質，所以在醫學檢驗中應用極為廣泛。常用于測定各種激素（如甲狀腺激素、性激素、胰島素等）、微量蛋白質、腫瘤標志物（如AFP、CEA、CA-125、CA-199等）和藥物（如苯巴比妥、氯丙嗪、慶大霉素等）等。各種檢測項目均有試劑盒供應，所以被廣泛采用。近年來其他標記免疫分析技術如酶免疫分析、發光免疫分析等在技術上有飛躍的進展，放射免疫分析有被取代的趨勢。但在生物醫學基礎研究中，新發現的生物活性物質日益增多，對它們的研究也是基礎醫學科研中的熱門課題。研究這些新的活性物質和某些疾病發生及發展的關系，需要高靈敏度、高特異性的檢測方法，其中放射免疫分析技術仍為首選。 4.4免疫比濁分析儀 臨床上測定微量蛋白(如Ig等)由最初的試管沉淀反應、瓊脂凝膠擴散試驗，發展到現代自動免疫分析技術，其靈敏度逐步提高，檢測水平由微克（μg)發展到納克(ng)，甚至皮克(pg)水平。微量蛋白免疫分析隨著自動化程度不斷提高，在臨床上得到廣泛應用，其自動化檢測方法主要為免疫比濁法。根據檢測原理的不同，又分為透射比濁法和散射比濁法。
(1)穩定性好 (2)分析簡便、快速 (3)避免污染； (4)標本用量少 4.4.1 免疫比濁測定的基本原理 4.4.1.1免疫透射比濁測定 免疫透射比濁度測定(turbidimetry)可分為沉淀反應免疫透射比濁測定和免疫膠乳濁度測定法。免疫比濁法測定的光路示意見圖16-3。
圖16-3免疫比濁法測定的光路示意圖 1.免疫透射比濁測定原理：抗原抗體在特殊緩沖液中快速形成抗原抗體復合物，使反應液出現濁度。當反應液中保持抗體過剩時，形成的復合物隨抗原增加而增加，反應液的濁度亦隨之增加。2.免疫膠乳濁度測定法原理：選擇一種大小適中、均勻一致的膠乳顆粒，吸附抗體后，當遇到相應抗原時，則發生凝集。單個膠乳顆粒在入射光波長之內，光線可透過。當兩個膠乳顆粒凝集時，則使透過光減少，這種減少的程度與膠乳凝聚成正比。 4.4.1.2激光散射濁度測定 激光散射濁度測定(nephelometry)按測試的方式不同分二種比濁法：即終點散射比濁法(end nephelometry)和速率散射比濁法(rate nephelometry)。 激光散射濁度的基本原理是：激光散射光系沿水平軸照射，通過溶液時碰到小顆粒的抗原—抗體免疫復合物時，導致光線被折射，發生偏轉。偏轉角度可以從00C ~900C，這種偏轉的角度可因光線波長和離子大小不同而有所區別。散射光的強度與抗原—抗體復合物的含量成正比，同時也和散射夾角成正比，和波長成反比。 1. 終點散射比濁法 在抗原—抗體反應達到平衡時，即復合物形成后作用一定時間，通常為30~60分鐘，復合物濁度不再受時間的影響，但又必須在聚合產生絮狀沉淀之前進行濁度測定。因此，終點散射比濁法是測定抗原與抗體結合完成后測定其復合物的量。 2.速率散射比濁法 是一種先進的動力學測定法。所謂速率是指在抗原—抗體結合反應過程中，在單位時間內兩者結合的速度。因此，速率散射比濁法是在抗原與抗體反應的最高峰(約在1分鐘內)測定其復合物形成的量，該法具有快速、準確的特點。 速率法的靈敏度和特異性都比終點法好，前者的靈敏度可比后者高3個數量級之大。自動化速率法的精密度也較好，但這與儀器的質量和性能關系密切。濁度法速率法的校正結果也較穩定，故可貯存使用一定時間。 4.4.2免疫比濁分析儀的種類和檢測原理 免疫透射比濁測定用自動生化分析儀進行檢測，雖可達到快速混勻目的，但IC很可能在離心力作用下沉淀，引起誤差。如果抗原或抗體量大大過剩，出現可溶性復合物，對于單克隆蛋白的測定，這種誤差更易出現，另外還可受血脂濃度的影響，造成假性升高。 激光散射濁度測定特別是速率散射比濁法具有快速、準確、靈敏度和特異性好的特點，在臨床上已推廣應用，下面介紹目前國內常用的該類儀器。 4.4.2.1 ARRAY特種蛋白分析測定系統 由微電腦控制，可以定量檢測體液中微量蛋白的全自動組合儀器。 儀器主要部件：散射測濁儀、、加液系統、試劑和樣品轉盤、分析儀上閱讀器 儀器主要特點：速率信號的獲取； 抗原過剩的監測；使用抗體、標準血清、抗體卡片和校正卡片，保證測定結果的準確性和精密度。 4.4.2.2 DBl00特種蛋白分析測定系統 儀器組成 DB 100特種蛋白分析測定系統，由分析儀、計算機(主機、CRT顯示屏和鍵盤，用于數據輸入和程序運行的操作，并可在顯示屏上顯示出來)、打印機、條碼讀取器四部分組成。分析儀是該系統的主要部分，包括散射測濁儀、加液系統、支架運輸裝置、比色杯裝置等。 儀器主要特點：其測定方法實質上是透射比濁的一種改良，利用發光二極管(840nm)作為光源，檢測在前向角130C~240C的散射光，由硅化光電二極管接收散射光信號，這種散射光的強度與免疫復合物濃度成正比。散射光電信號與貯存在計算機內的標準曲線進行比較，然后轉換成檢測物的濃度單位。 4.4.2.3 IMMAGE免疫分析測定系統 IMMAGE免疫分析測定儀是繼ARRAY 360CE特種蛋白分析測定系統之后，推出的新一代全自動特種蛋白分析、藥物濃度監測為一體的免疫分析系統。 IMMAGE免疫分析測定儀使用760nm和近紅外940nm波長作為光源，采用速率散射比濁(Rate Nephelometry)、速率抑制散射比濁(Rate Inhibition Nephelometry)、速率近紅外顆粒透射法(Rate Nearh—frared Particlemmunoassa)、速率抑制近紅外顆粒透射法(Rate lnhibition Near lnfrared Particle lmmunoassay )四種檢測技術，并采用不同的散射角度測量發散的散射光強度，90角度的散射法測定小顆粒(直接反應產物)，0角度的透射度檢測大顆粒(抗體顆粒結合物)，擴大檢測免疫項目范圍，增強了檢測敏感度和精度，減少了非特異性顆粒的干擾。 IMMAGE免疫分析測定儀加大抗原過量檢測范圍以區分非特異性反應使檢測結果更加準確可靠，添加了試劑冷藏系統增加試劑的穩定性，采用全方位的條形碼系統可以自動檢測試劑及試劑的批號、校正的狀態、試劑過期的日期、試劑的體積及質控、標準和樣品標本，具有雙試劑加樣探針(避免交叉污染)和智能液面感應器，處理標本自動化程度高(75—180測試／h)。 4.4.2.4 BN Prospec特種蛋白免疫分析儀 BN Prospec特種蛋白免疫分析儀是2000年推出的新一代全自動特種蛋白免疫分析系統，儀器由主機、計算機、顯示器和打印機組成。使用遠紅外發光二極管作為光源，采用固定時間散射比濁(Fixed time Nephelometry)、終點散射比濁(Final Measurement Nephelometry )和Vlin—Integral散射比濁法三種檢測技術，部分試劑采用了乳膠增強劑，提高反應靈敏度，大大加強檢測范圍。 BN Prospec特種蛋白免疫分析儀主機由樣品盤、冷藏試劑盤、稀釋盤、反應盤、探針和注射器組成。 4.4.3 免疫比濁分析的臨床應用范圍 1．免疫功能監測 免疫球蛋白A、免疫球蛋白C、免疫球蛋白M、免疫球蛋白輕鏈?、免疫球蛋白輕鏈λ、補體C3、補體C4、C－反應蛋白等。 2．心血管疾病檢測 載脂蛋白A1、載脂蛋白B、脂蛋白a、C—反應蛋白等。 3．炎癥狀況監測 C—反應蛋白、α1—酸性糖蛋白、觸珠蛋白、銅藍蛋白等。 4．類風濕性關節炎的檢測 類風濕因子、C—反應蛋白、抗鏈O等。 5．腎臟功能監測 微量白蛋白、α1—微球蛋白、β2—微球蛋白、轉鐵蛋白、免疫球蛋白G等。 6．營養狀態監測 白蛋白、前白蛋白、轉鐵蛋白等。 7．新生兒體檢 C—反應蛋白、免疫球蛋白A、前白蛋白、免疫球蛋白G等。 8．凝血及出血性疾病的檢測 抗凝血酶Ⅲ、轉鐵蛋白、觸珠蛋白等。 9．貧血監測 觸球蛋白、轉鐵蛋白等。 10．血腦屏障監測 腦脊液白蛋白、免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M。 4.5 時間分辨熒光免疫分析儀 熒光免疫測定同酶免疫測定一樣，根據抗原抗體反應后是否需要分離結合的/游離的熒光標記物而分為均相和非均相兩種類型，基本反應式如下：Ab*+Ag→Ab*Ag+ Ab*(Ab*Ag代表結合的標記物，Ab*為游離的標記物)。在抗原抗體反應后，先把Ab*Ag與Ab*分離，然后測定Ab*Ag或Ab*中的標記物的量，從而推算出標本中的Ag量，該方法稱為非均相熒光免疫測定法，如時間分辨熒光免疫測定(time-resolved fluorescence immunoassay, TRFIA)本章節重點介紹非均相熒光免疫測定法的時間分辨熒光免疫測定儀。 4.5.1時間分辨熒光免疫檢測原理 該技術的基本原理為：用鑭系三價稀土離子及其螯合物(如Eu3+ 螯合物)作為示蹤物標記抗原、抗體、核酸探針等物質；當免疫反應發生后，根據稀土離子螯合物的熒光光譜的特點（特異性強、巨大Stokes位移、熒光壽命長），用時間分辨熒光分析儀延緩測量時間，排除標本中非特異性熒光的干擾，所得信號完全是稀土元素螯合物發射的特異熒光，測定免疫反應最后產物的特異性熒光信號。根據熒光強度判斷反應體系中分析物的濃度，達到定量分析的目的。 與一般的熒光分光光度儀不同，時間分辨熒光分析儀的激發光與熒光的波長差別顯著，其波長轉變達280nm，采用脈沖光源(每秒閃爍1000次以上的氙燈)，
圖16-4 時間分辨熒光原理 照射樣品后即短暫熄滅，以電子設備控制延緩時間，待非特異熒光本底衰退后，再測定樣品發出的長壽命鑭系熒光。 時間分辨熒光免疫分析的特點 特異性強 標記物為具有獨特熒光特性的稀土金屬---鑭系元素，主要包括銪(Eu)、釤（Sm）、鏑(Dy)、锝(Te) 四種。稀土離子的熒光激發光波長范圍較寬，而發射光波長范圍甚窄，同時激發光和發射光之間有一個較大的Stokes位移（大約290nm），如銪元素發射光613nm、激發光340nm，熒光素的Stokes位移為280nm；這十分有利于排除非特異熒光的干擾，采用干涉濾波片就可以消除散射光引起的干擾，從而提高了熒光信號測量的特異性。 靈敏度高 稀土離子鰲合物所產生的熒光不僅強度高，而且半衰期長（例如：銪元素的半衰期為430μs，普通熒光免疫分析中熒光團的衰變時間只有1～100μs，樣品中的一些蛋白質的熒光衰變時間僅為1～10μs），因此利用延長測量時間，待測樣品中短壽命的自然熒光完全衰變后再測稀土離子鰲合物的熒光信號，即將特異性熒光與非特異性熒光分辨開來消除了來自樣品熒光的干擾，大大提高了檢測靈敏度，同時擴大了檢測范圍。 標記物穩定 三價稀土離子與雙功能鰲合劑鰲合，形成穩定的鰲合物，從而使標準曲線穩定，試劑保質期長。時間分辨熒光免疫檢測的標準曲線相當穩定，同一批次的試劑盒可用兩點法加批次的參考曲線定標。 線性范圍寬，重復性好 解離－增強時間分辨熒光免疫分析法（DELFIA）熒光檢測分析中加入一種酸性增強液，稀土離子從免疫復合物中解離出來，并和增強液中的一些成分形成一種穩定的微囊，當微囊被激光激發后則稀土離子發出長壽命的熒光信號，使原來微弱的熒光信號增強100萬倍。 4.5.2 時間分辨熒光免疫分析儀測試原理和基本結構 目前國內已經開發生產出不同型號的時間分辨熒光免疫強度測試儀/分析系統，并有相應配套試劑可供臨床實驗室選用，現將該類分析儀的測試原理和基本結構介紹如下。 為了解該類儀器的基本結構，工作原理和使用方法，以DELFIA 1230時間分辨熒光儀為例作一介紹，見圖16-5。
圖16-5 DELFIA1230時間分辨熒光儀的原理圖
4.5.3.1蛋白質和多肽激素分析 一般多使用雙位點“夾心” 法測定免疫球蛋白E、人絨毛膜促性腺素、磷脂酶A2、胰島素、C反應蛋白、促黃體生成素、催乳素、髓磷脂堿性蛋白、鐵蛋白、卵泡刺激素、促甲狀腺素等自分析等。 4.5.3.2半抗原分析 用競爭結合熒光免疫分析法測定皮質醇、睪丸酮、地高辛、前列腺素F、甲狀腺素、三碘甲狀腺原氨酸、孕酮、孕烷二醇、雌二醇、雌三醇、雌酮、葡萄糖醛酸等。 4.5.3.3病原體抗原/抗體分析 如肝炎病毒表面抗原抗體、蜱致腦炎復合病毒抗原、免疫缺陷病毒抗體、糞便中腺病毒和輪狀病毒、Potato病毒、流感病毒A、鼻病毒、衣原體、腸病毒、梅毒螺旋體、乳頭瘤病毒和呼吸道合胞病毒等分析。 4.5.3.4腫瘤標志物分析 例如，甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特異抗原、神經原特異烯醇酶、CA50、CA242、CAl99、β2—微球蛋白和甲狀腺結合球蛋白等的分析。 4.5.3.5干血斑樣品分析 把有血樣品的濾紙片放在裝有分析緩沖液的孔中，振蕩使抗原溶于緩沖液中。本法特別適用于新生兒和遠離分析中心的病人 4.5.3.6核酸分析 時間分辨熒光分析應用于核酸分析領域主要有兩個方面。一是應用鑭系元素標記的DNA探針技術進行雜交分析；二是將鑭系元素標記技術引入聚合酶鏈反應(PCR)中，簡單、快速地鑒定PCR產物。樣本核酸不必經過電泳，直接點樣到濾膜或微孔中進行雜交，即引入雜交體系中的Eu3+，在加入增強液后測量。或者用Southern印跡雜交與Northern印跡雜交，固定于尼龍膜或硝酸纖維素膜上與Eu3+標記的核酸探針進行雜交分析。引入雜交體系的Eu3+螯合物可在固相下測量，因而可在時間分辨熒光掃描儀下進行準確定位并檢測特異的DNA或RNA電泳條帶。另外，尚有嵌套式PCR—TRF技術和把TBP(Eu3+)與快速收集系統相結合測定特異放大的靶DNA。 4.5.3.7測定天然殺傷細胞的活力 用Eu3+—DTPA(Eu3+—二乙三胺五醋酸鹽)標記腫瘤細胞，作為NK細胞的靶細胞。當這靶細胞受到NK細胞毒害時會釋放Eu3+—DTPA標記物。用時間分辨熒光儀測量所釋放的這標記物的熒光，即可測量NK細胞的活力。本法溫育時間短，一般只用2h，測量快速，每樣品只需1s；靈敏度高，可測至單個細胞。 TRFIA優點突出，研究工作活躍，發展迅速。新的儀器、試劑和方法不斷出現。應用范圍日益擴大和普遍。目前已有30多種試劑盒和成套儀器、試劑面世，成為一種新的很有潛力的免疫分析技術，倍受重視。我國在儀器、試劑、方法和應用等方面的研究已取得了較大進展，有商品面世，投入實際使用。 除了上述幾種主要的免疫分析方法外，目前還發展了核酸免疫、免疫PCR技術、DNA免疫、基因免疫技術等高專一性、高靈敏性的技術。從測定原理和應用上看，免疫分析的發展將存在兩條并行的路線。一是免疫分析法繼續在分析的可靠性和靈敏性上不斷的革新、完善和進步，為生化研究和臨床分析提供更為準確和實用的新方法；二是伴隨現代生物技術的不斷發展，免疫分析將滲透到各種全新的研究領域，這將集中表現在以下方面：①基因工程抗體（gene-engineering Ab，又稱recombination Ab）的應用；② 催化抗體（catalytic Ab）的應用；③ 新原理的多組分測定（multiresidue IA）；④ 金屬離子的免疫分析。 |
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