Research Article，2024-05-09，Microbiome，[IF 15.5]
原文鏈接：https://link./article/10.1186/s40168-024-01791-3
第一作者：Ming Yan （嚴鳴)
通訊作者：Zhongtang Yu （于忠堂）
通訊單位：美國俄亥俄州立大學動物科學學院 （Department of Animal Sciences, The Ohio State University, Columbus, OH, USA)
美國俄亥俄州立大學微生物組研究中心 （Center of Microbiome Science, The Ohio State University, Columbus, OH, USA)
基于本團隊于2023年8月29日，發表在Nature communications的研究（https://www./articles/s41467-023-41075-2），美國俄亥俄州立大學動物科學學院以及微生物組研究中心的Zhongtang Yu教授團隊于近日在Microbiome發表了其后續的研究成果，題為Viruses contribute to microbial diversification in the rumen ecosystem and are associated with certain animal production traits (https://link./article/10.1186/s40168-024-01791-3)
瘤胃微生物組中的細菌和其他微生物共同將反芻動物難以直接利用的植物高纖維成分轉換成能量，并且產生高品質的微生物蛋白，供動物合成自身蛋白質。然而，這個轉換過程效率低下，同時伴隨著大量溫室氣體的排放。針對瘤胃微生物組的眾多研究致力于通過調節瘤胃中的微生物發酵過程，以提高生產效率并減少溫室氣體排放。然而，噬菌體作為微生物生態中的關鍵調控元素，它如何調整瘤胃微生物群落的結構，從而進一步影響瘤胃發酵以及反芻動物的生產表現以及甲烷排放，這一問題依舊沒有得到充分的闡釋。
利用本課題組最新建立的瘤胃病毒組數據庫（RVD），本研究進一步在種與株水平上，通過同時分析551個瘤胃宏基因組的病毒與細菌組成，闡明了微生物和病毒在共同進化、共存模式以及群體分布之間的相互作用。此外，本研究通過分析在細菌基因組中的原噬菌體（prophage），評估了瘤胃噬菌體在微生物多樣化中的潛在作用。通過病毒-微生物共存網絡以及侵染網絡分析，本研究表明，瘤胃中的噬菌體可以通過對立（antagonistic）和互利（mutualistic）的相互作用，在菌株和群落水平上調控微生物。此外，本研究確定，瘤胃病毒組組成，與關鍵的動物生產性狀相關聯，包括飼料轉化效率和甲烷排放效率。這些發現為進一步探索瘤胃中病毒組在調節微生物組分化與組成，和影響整體動物生產性能中的作用提供了實質性的框架。
瘤胃微生物組通過消化動物宿主無法消化的纖維性飼料，以及將低營養價值的飼料蛋白轉化為高營養價值的微生物蛋白，在反芻動物營養利用上發揮著至關重要的作用。然而，其所涉及的微生物轉化效率不高，且在此過程中導致大量甲烷和的廢氮排放。大量研究試圖闡明瘤胃微生物組內部的相互作用，尤其是關注其與動物管理、動物遺傳學和動物表型的關聯。值得注意的是，除了極少數外研究外，所有這些研究都只強調了細菌、古菌、原生動物和真菌的作用，而大大忽視了瘤胃病毒。因此，盡管瘤胃噬菌體是瘤胃生態系統中不可忽視的組成部分，且在瘤胃微生物生態系統中起到了生態位調控者的作用，人們對瘤胃噬菌體在促進瘤胃微生物進化與組成，以及其對與宿主表現型的作用仍了解不足。
微生物病毒在不同生態系統中皆具有重大影響。在海洋環境中，病毒每天裂解約20%的微生物，造成100億噸的日均碳排放，并通過“病毒分流”（viral shunt）極大地影響生物地球化學循環。人類腸道病毒組相對穩定，但在個體的一生中顯示出相當大的多樣性，并與慢性疾病相關聯。瘤胃病毒同樣具有高度的多樣性，并能侵染包括產甲烷菌在內的多樣化的瘤胃微生物。通過在不同營養層次（trophic levels）上裂解瘤胃微生物，瘤胃病毒可能調節其微生物宿主的種群組成，從而調節營養物質和微生物蛋白的循環。因此，揭示瘤胃生態系統內病毒-微生物相互作用的復雜性，對于高效、長效的調控瘤胃發酵以及動物生產效率，包括飼料利用效率、泌乳性能和甲烷排放等方面具有重要作用。
病毒通過幾種假設的病毒-微生物相互作用模式，如“kill the winner”、“piggyback the winner”和“arms-races”，影響著微生物的多樣性、種群動態和代謝活動。具體而言，通過選擇性地裂解優勢微生物，病毒有助于維持群體多樣性。它們還通過促進水平基因轉移以及適應性共同進化（adaptive co-evolution），促進宿主適應性和多樣化。除此之外，無論是隱性（cryptic）的還是非隱性(non-cryptic)的原噬菌體，都作為輔助基因庫，攜帶提高宿主生存能力的基因。最后，病毒可以通過提供輔助代謝基因（AMGs）直接影響宿主的代謝，從而影響環境和胃腸生態系統（包括人類腸道和瘤胃）中的關鍵生態過程。
先前的研究記錄了反芻動物瘤胃病毒組對飲食變化的響應，并提出了它們對關鍵瘤胃細菌的潛在影響。然而，對于瘤胃病毒組的多樣性、與宿主的互動以及其在調控瘤胃功能和動物生產性能方面的作用，目前的了解仍然很有限。為了彌補這一知識空白，我們最近利用最新的生物信息學流程，針對近1000個瘤胃宏基因組的宏基因組病毒組分析，開發了一個全面的瘤胃病毒組數據庫（RVD）。我們揭示了感染瘤胃內各種細菌、古生菌和原生動物類群的病毒的巨大多樣性，以及一系列多樣的輔助代謝基因（AMGs），包括那些編碼關鍵酶如纖維素酶的基因。這些病毒的發現以及它們與宿主的聯系，暗示了它們對瘤胃生態系統的重大影響。在這些發現的基礎上，我們假設瘤胃病毒組與微生物組在多個范疇內密切互動，并與包括甲烷排放在內的重要動物生產性狀相關聯。為了驗證這一假設，我們系統地在菌株水平上對噬菌體進行了表征與進化學分析，以解密病毒宿主在種內及種間（inter- and intra-species）特異性。此外，我們構建并比較了微生物-病毒共存以及感染網絡，以確定瘤胃病毒在塑造瘤胃微生物組結構中的作用。最后，我們分析了10項獨立研究中的瘤胃宏基因組，揭示了瘤胃病毒組、微生物組與關鍵動物生產性狀之間的關聯，包括飼料效率和甲烷排放效率。總體而言，這些結果表明瘤胃病毒組在調節微生物生態結構、進化、多樣化和功能方面發揮著關鍵作用，并且與重要的動物生產性狀密切相關。
前期方法優化
為更好的研究物種水平上的噬菌體-細菌互作，本文作者首先基于GTDB數據庫，以及幾千個多樣的瘤胃原核生物基因組（MAGs）客制了基于GTDB物種分類的kraken2 分類工具（Rumen Kraken2 Classifier）。Rumen Kraken2 Classifier相較于基于標準數據庫（kraken2 standard database）,識別率（classification rate）從20%提升至接近75%， 加入的瘤胃原核生物基因組在此基礎上進一步提升了3%的識別率（Supplementary Fig. 1a）。除此之外，Rumen Kraken2 Classifier因為基于GTDB分類法，使得絕大大部分序列都能在物種水平上被分類。因此，通過使用Rumen Kraken2 Classifier和RVD，我們得以在物種水平上分析噬菌體-細菌的相互作用。
Supplementary Fig. 1a：Rumen Kraken2 Classifier大幅提升物種水平識別率。
基于此工具，作者在物種水平上重新識別了一系列核心瘤胃原核生物（存在于全部975個瘤胃宏基因組樣品; Supplementary Fig. 2），以區別于此前基于16s序列和NCBI 分類法的結果，且使我們得以在物種水平上了解瘤胃病毒對關鍵瘤胃原核生物的影響。結果顯示了Prevotella在瘤胃微生物群落中占絕對的主導地位。出乎意料的是，盡管產甲烷菌普遍存在于瘤胃生態系統中，沒有任何單一產甲烷菌物種存在于所有樣品中。
Supplementary Fig. 2: 基于GTDB分類法的核心瘤胃微生物及其分布。
我們緊接著通過100次隨機迭代（見原文方法），測試了核心瘤胃微生物是否存在冗余（某些核心物種是否可能不存在于新增的樣品中；Supplementary Fig. 1b）。結果顯示，核心瘤胃物種在物種水平上達到平滯（plateau），證明了所得到核心瘤胃微生物物種的可靠性。
Supplementary Fig. 1b: 核心瘤胃微生物物種數量在100次隨機迭代中顯示為收斂。
原噬菌體分析
通過分析瘤胃原核生物基因組的原噬菌體序列, 我們發現大多數瘤胃原核生物基因組都包含至少一個的原噬菌體序列（Fig. 1a）, 且大多數識別到的原噬菌體未能被歸為已知的噬菌體family （Fig. 1b）。功能上，研究發現了攜帶抗生素抗性基因的原噬菌體（Fig. 1c）。進化學上，通過在株水平上分析RUG2的240個宏基因組數據，我們發現大多數瘤胃宏基因組樣品至少有一個物種存在由原噬菌體導致的菌株水平的異質性（Fig. 1d），且攜帶的原噬菌體基因可能直接導致細菌菌株水平的分化。具體而言，我們發現一個攜帶原噬菌體的菌株與其他同一物種的不同菌株同時存在于37個不同的樣品，且其中的一個功能未知的原噬菌體基因在大多數樣品中的被正向選擇（pN/pS > 1）。
Fig. 1：從反芻動物瘤胃微生物基因組中鑒定出的原噬菌體。
株水平的感染特異性
通過在菌株水平上分析噬菌體的感染規律，我們發現噬菌體通過菌株水平上的宿主特異性，以調控其宿主的多樣性（Fig. 2）。具體而言，盡管多數噬菌體只能侵染單一菌株，我們仍發現了能同時侵染不同菌株的噬菌體，其中部分噬菌體能侵染不同物種的多個菌株。與此同時，我們發現部分菌株能夠免疫噬菌體感染。總的來說，在微生物防御與病毒反防御之間的動態平衡可能導致由于genetic sweeps而引起的豐度波動。同時，復雜的嵌套感染（噬菌體感染多種菌株/物種和微生物被多種噬菌體感染）突顯了病毒與微生物之間錯綜復雜的相互作用。
Fig. 2: 反芻動物瘤胃病毒的菌株水平宿主特異性。
共生網絡揭示瘤胃病毒生態位調控重要性
我們還構建了一個病毒-微生物共生網絡（phage-microbe network）來并與微生物共生網絡（microbe-only network）相比較以研究病毒與微生物之間的相互作用（Fig. 3）。Phage-microbe network包括570個病毒節點和671個也存在于microbe-only network的微生物節點。在phage-microbe network中，有22個微生物節點沒有與其他微生物節點連接。僅考慮微生物節點時，平均度中心性（centrality）為5.23（±3.94），顯著高于microbe-only network（p < 0.001）。雖然模塊化指數（modularity index）為0.60，相比于microbe-only network略低，但Phage-microbe network仍展現出高度的的群體連接。微生物-病毒交互可能標志著共存策略，不論是作為宿主微生物內的原噬菌體還是與抗病毒微生物（virus-resistant）共存的裂解性病毒。在后一種情況下，這可能是因為抗病毒微生物受益于由于競爭減少以及被裂解性病毒裂解的微生物釋放的營養物質增加。因此盡管病毒在細胞層面可能表現為對抗性，但病毒-微生物網絡中微生物節點的連接性增加和同質性的減少（augmented connectivity and reduced assortativity），表明病毒可能促進微生物間的相互作用，并允許多樣的微生物占據相同的生態位。這一推論進一步得到了Fig. 2a所示的模塊化和嵌套的病毒-微生物感染網絡的支持。總的來說，這些復雜的病毒-微生物相互作用超出了捕食-被捕食關系，并表明瘤胃病毒和微生物在微生物群落水平上可能是互惠互利的，這支持了先前在人類腸道生態系統中的發現。噬菌體之間的相互作用可能則源于由噬菌體引起的超感染免疫（superinfection immunity）或同一細菌物種的共同感染。
Fig. 3: 共生網絡展示了瘤胃微生物組的模塊化組織和微生物-病毒的相互作用。
瘤胃病毒作為基石物種（keystone species）調控瘤胃菌群結構
我們同時發現了具有高degree centrality和betweenness centrality的瘤胃病毒，說明瘤胃病毒在維持微生物生態結構性的重要作用（Supplementary Fig. 6）。
Supplementary Fig. 6: 作為基石物種的瘤胃病毒與瘤胃細菌
瘤胃病毒與動物生產性狀關聯
反芻動物瘤胃微生物組、飲食攝入、動物生產表現以及甲烷排放之間的復雜聯系是反芻動物瘤胃微生物組研究中的一個關鍵點。然而，很少有研究探討了瘤胃噬菌體與上述因素或特定生產特性的交互作用。迄今為止，只有一項研究展示了飲食能量水平對瘤胃噬菌體和微生物組的影響。在當前研究中，我們分析了來自9個獨立研究（包括不同的處理組）的311個瘤胃宏基因組以及RUG2 數據組的240個樣品的噬菌體以及微生物組成，以探究瘤胃噬菌體、其微生物宿主、動物營養調控和動物生產特性之間的關聯。結果顯示，日糧組成與動物生產效率都可影響噬菌體的豐富度，但影響程度不一（Fig. 4a）。肉牛的平均日增重和綿羊的甲烷排放量與瘤胃病毒的豐富度呈正相關，但肉牛和乳牛的飼料效率、牛奶蛋白質產量和飽和脂肪酸產量與噬菌體豐富度之間沒有顯示出任何關聯（Fig. 4b）。瘤胃噬菌體與某些動物生產性能指標之間缺乏顯著關聯可能歸因于動物本身的因素。在分析同一瘤胃宏基因組中微生物豐富度與病毒豐富度之間的相關性時，只有在一些處理組中觀察到微生物組和噬菌體豐富度之間的顯著相關性，而且沒有一致的方向性，這表明其他因素可能影響它們的相互作用和種群動態。鑒于瘤胃噬菌體的高度個體化特性，瘤胃病毒和微生物之間的相互作用，尤其是那些低豐度的微生物，可能受到決定性因素例如飲食和動物遺傳，以及其他隨機性因素影響。
Fig. 4: 瘤胃病毒的豐富度與日糧組成以及動物生產特性相關聯。
我們進一步分析了不同動物群體間瘤胃噬菌體的β多樣性，結果顯示瘤胃噬菌體組成在不同飲食（Fig. 5a）以及生產性能（Fig. 5b）之間存在差異。盡管一些研究報告了瘤胃微生物組成與上述處理之間的相關性，但結果存在不一致性。
Fig. 5: 不同飲食組成和不同動物生產特性之間的瘤胃噬菌體組成差異
除了改變微生物組結構外，瘤胃中的病毒還可能通過影響關鍵微生物物種的豐度直接調節其中的發酵過程。通過差異豐度分析，我們鑒定了幾十個在不同飲食組成（Fig. 6a）和動物生產指標（Fig. 6b）中豐度不同的vOTUs（q < 0.1）。由于相當比例的vOTUs無法在vOTUs以上的任何分類級別進行分類，因此僅在vOTUs水平上分析了豐度差異。一些豐度差異顯著的vOTUs的宿主也顯示出了在不同處理組中差異性的豐度（q < 0.1；在Fig. 6中以紅色箭頭標示）。由于上述差異性顯著的vOTUs為溶原性噬菌體，它們的分布趨勢可能象征著不同的生命周期。
Fig. 6: 在飼喂不同飼糧或具有不同效率的反芻動物中，噬菌體及其感染的細菌豐度差異性分布。
最后，通過比較瘤胃宏基因組中病毒-宿主的VHR（病毒宿主比率），我們評估了飲食或動物生產性能與溶原噬菌體生命周期變化之間的潛在關聯。我們發現，不同日糧組成的溶原噬菌體的VHR顯著差異（Supplementary Fig. 8a）。這種差異很可能是由于增加的飼料發酵和短鏈脂肪酸（SCFAs）的產生所致，而這些已知能夠誘導溶原噬菌體。實際上，某些食物和食物提取物已被顯示能夠在人類微生物組中誘導溶原噬菌體。例如果糖和SCFAs可誘導腸道微生物中的溶原噬菌體生命周期的轉變。此外，亞急性瘤胃酸中毒，通常由高濃縮飼料飲食的動物快速產生SCFA引起，也顯示能夠顯著增加瘤胃病毒的豐度。與此同時，在具有不同甲烷效率的動物群體中，病毒宿主比率也存在顯著差異（Supplementary Fig. 8b）。因此，雖然瘤胃噬菌體組的變化在很大程度上反映了微生物組結構的改變，但瘤胃環境的變化可能調節病毒生命周期動態，這反過來又可以影響瘤胃微生物組結構以及微生物發酵。
Supplementary Fig. 8: 病毒宿主比率在不同處理組中存在顯著差異。
由病毒裂解引起的瘤胃微生物的周轉（turnover）可能對某些瘤胃功能，特別是發酵和微生物蛋白質合成產生深遠影響。盡管經估計海洋噬菌體每天裂解約20%的海洋細菌，但歸因于病毒的瘤胃微生物裂解率仍然未定。考慮到瘤胃中病毒和微生物的高豐度，瘤胃內的病毒裂解可能相當可觀。因此，我們提出了兩個關鍵問題：病毒介導的特定瘤胃微生物（特別是那些與動物生產性能和甲烷排放相關的微生物）和總體瘤胃微生物周轉率是多少？溶源性和裂解性循環在瘤胃生態系統中各占據何種比例，是否能通過調控日糧組成加以影響？早期的研究使用透射電子顯微鏡計數噬菌體，或使用瘤胃內總噬菌體DNA濃度對噬菌體群體大小進行了估計。然而，高噬菌體計數并不一定與高微生物宿主死亡率相關。例如，即使在高free phage particles濃度的情況下，僅有不到1%的cyanobacteria細胞被感染。值得注意的是，上述兩種方法可能低估了噬菌體的豐度，因為它們主要計算自由裂解噬菌體(free lytic virions)。相比之下，通過宏基因組序列計算得到的病毒宿主比例（VHR）不僅可以量化free virions和temperate phages，還可以量化intracellular lytic phages。此外，單細胞聚集體(single-cell polony)方法可以同時識別數千個不同微生物細胞的病毒感染情況。利用這些方法，未來研究應關注量化病毒與宿主組成、宿主死亡率及其與瘤胃生態系統中凈微生物蛋白質合成的關聯。
總之，本研究深入探討了瘤胃生態系統內病毒的角色，這一領域至今仍然大體上未知。通過對瘤胃宏基因組的全面分析，我們初步揭示了的病毒-微生物之間的復雜關系，為微生物生態系統組成之間的多樣性、共生現象和相互作用提供了新的見解。此外，本研究表明，瘤胃病毒可能通過對立和互利的相互作用，在菌株和群落層面對瘤胃微生物施加調節作用。值得注意的是，瘤胃病毒組表現出對飼喂條件以及重要的動物生產性狀（如飼料效率和甲烷排放效率）相關聯。這些發現為未來的研究工作奠定了堅實的基礎，包括解讀瘤胃病毒組在塑造瘤胃微生物組及其對整體動物生產性能的影響。未來的研究還應該調查瘤胃中的單鏈DNA或RNA病毒，因為它們在RVD和瘤胃宏基因組中代表性不足。
Yan, M., Yu, Z. Viruses contribute to microbial diversification in the rumen ecosystem and are associated with certain animal production traits. Microbiome 12, 82 (2024). https:///10.1186/s40168-024-01791-3
嚴鳴，俄亥俄州立大學博士生，即將入職加州大學伯克利分校創新基因組研究所，主要從事宏基因組學與生物信息學的研究。近兩年以第一作者在Nature communications, Microbiome, Critical Reviews in Food Science and Nutrition等期刊上發表論文5篇，以共同第一作者在Science of the total environment發表論文一篇。
于忠堂，美國俄亥俄州立大學教授、博士生導師。Microbiome、Journal of Dairy Science等雜志編輯。研究方向包括家畜腸道微生物與環境微生物生態學研究和生物質廢棄物轉化的微生物學基礎研究等。在The ISME Journal、PNAS、Nature communications、和Microbiome等刊物發表文章200余篇，所發文章被引用超過21000次。
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