【原】【LorMe周刊】盜取自然的武器庫：Meta-SIFT技術挖掘宏基因組“暗物質”重塑噬菌體宿主范圍

周刊主要展示優秀周報，每周定期為您奉上學術盛宴！本期周刊為您介紹通過深度挖掘宏基因組序列來設計噬菌體。原文于2025年發表在《Science Advances》上。

導讀

傳統噬菌體改造依賴隨機突變或自然變異，難以高效探索龐大的序列空間（如10個氨基酸序列有10131013種組合）。Keith團隊開發了Meta-SIFT（宏基因組序列信息功能評分），首次利用宏基因組數據庫中隱藏的功能基序（motif）精準設計噬菌體。該方法通過DMS數據構建位點特異性評分模型，從6.1萬個宏基因組結構蛋白中篩選非同源功能基序，結合高通量合成與ORACLE噬菌體文庫技術，成功賦予T7噬菌體跨界宿主感染能力（如靶向食源性病原體大腸桿菌O121）。

主要結果

一、Meta-SIFT技術實現跨物種功能基序深度挖掘

通過深度突變掃描（DMS）系統量化了T7噬菌體受體結合蛋白（RBP）尖端結構域（殘基472-548）的1,660個單點突變在5種宿主中的功能變化（圖1A），構建三維權重種子評分模型——位置權重（外環區S477評分＞8，β折疊區V482＞7，較內部環區高40%，圖1B紅色梯度）、功能分化權重（BW25113ΔrfaG耐藥株活性提升突變加分＞0.5）、進化保守權重（跨宿主活性差異＞0.5的突變優先保留）——據此從61,017個宏基因組結構蛋白（經HMM篩選自NCBI/IMG/VR數據庫，VOGDB v94定義373個病毒標志蛋白）中挖掘出19,109個候選基序，其中6mer基序（15,561個）平均含5.28±0.84個突變（野生型同區域僅0.2突變，提升26倍），10mer基序（3,549個）平均8.87±1.1個突變（圖1C），72%基序位于直接接觸宿主的DE外環與E β折疊區（圖1D），且45%源自長尾噬菌體科（Siphoviridae）、38%源自肌尾噬菌體科（Myoviridae），僅12%來自T7所屬短尾噬菌體科（Podoviridae）（圖1F）；隨機化種子評分使基序檢出率驟降10倍（結構蛋白基序數從19,109→1,901，圖1E），非結構蛋白對照實驗（聚合酶/連接酶數據集）基序數不足結構蛋白10%（1,502 vs 19,109，圖1E左），雙重驗證DMS數據是打破同源局限、解鎖宏基因組“暗物質”的核心引擎。

圖1 Meta- SIFT從宏基因組噬菌體序列中識別不同的基序

在涵蓋三類臨床與環境脅迫場景的20種大腸桿菌篩選平臺中（圖2A，7種LPS受體缺陷株，ΔrfaC/ΔrfaG等模擬耐藥環境）、3種尿路致病臨床分離株（UTI9/UTI26/UTI46）、食源性病原體O121在0-2% NaCl梯度下的鹽脅迫模型，ORACLE技術成功表達17,636個變異噬菌體（成功率92.3%，突變分布與設計一致），篩選發現24.5%變異體（4,328/17,636） 在至少一種宿主中活性顯著超越野生型（log?F?＞0，圖2D），其中BC外環區（位置475-490）因天然序列含4個甘氨酸（G477/G479/G480/G482）且無電荷殘基，成為宿主擴展核心熱點（容納86%活性基序，圖2F）；通過Spearman相關性與Ward聚類法將活性變異體劃分為50個功能簇（圖4C），揭示關鍵設計規律：廣宿主簇15（38成員，如基序"RRASGG"）依賴BC環區正電荷突變（R479頻率61.8%，H480達42.1%）增強與帶負電LPS結合，感染19/20宿主（含UTI株及1% NaCl下的O121，圖4D），而靶向高鹽O121的基序（如簇50的"GGIARA"）在2% NaCl下富集S475R（頻率37.2%±3.1，圖5B）/G479K（28.5%±2.7，圖5B等正電荷突變，中和宿主表面鹽離子屏蔽效應，使工程化T7裂解效率（EOP）從0（野生型）突破至10^?3（"GGIARA"）及10^??（"IARTGS"）（圖5D），但伴隨顯著宿主范圍權衡——O121高效變異體在BL21宿主活性降低50%（F?從1.0→0.5，圖5D）。

圖4 分層聚類揭示了基序選擇的模式

針對野生型T7及DMS單點突變庫（＞1,600變異體）完全無效的食源性病原體O121（STEC-O121血清型，2% NaCl下EOP=0，圖2B），Meta-SIFT設計的兩組基序實現三重突破：①高鹽裂解效能革命——基序"IARTGS"（S477I/G479R/G480T/V482S）在2% NaCl下使EOP達10^??（圖5D），液體培養4小時內OD???下降99%（ΔOD=2.1→0.02），其機制通過正電荷突變（S475R頻率37.2%→較0% NaCl提升3.1倍，圖5B）重塑宿主識別界面，且V482S突變（18.4%）增強β折疊柔韌性以適配鹽畸變受體；② 傳統方法失效對照——BLAST同源基序組合（1,041,754種可能）僅0.002%（29個）有微弱活性（F?＜0.5），DMS單點突變庫在O121高鹽條件全數失效（圖2B）；③治療應用落地——工程化T7對O121的裂解效能超越臨床噬菌體雞尾酒療法基準（EOP>10^??），成本效益分析顯示Meta-SIFT篩選效率達傳統方法的120倍（每美元投入獲得活性變異體數：BLAST 0.08個 vs Meta-SIFT 9.6個），為腌制品防腐（＞8% NaCl環境）及多重耐藥菌感染提供可編程解決方案。

圖5 Meta- SIFT鑒定食源性病原體大腸桿菌O121的活性基序

Meta-SIFT通過三重技術革命——DMS驅動的動態評分模型、宏基因組非保守基序挖掘、ORACLE高通量精準構建，將噬菌體設計效率提升＞100倍（傳統BLAST篩選耗時成本為Meta-SIFT的120倍），首次實現實驗室噬菌體T7向臨床應用的轉化（O121高鹽下EOP達10^??，超越雞尾酒療法基準10^??）。其臨床價值在于攻克傳統療法失效的食源性耐藥病原體（如STEC-O121血清型），為腌制品防腐（＞8% NaCl環境）及燒傷感染（高滲創面）提供定向解決方案，同時揭示宿主范圍權衡機制，為多噬菌體種群聯合療法奠定基礎。未來可拓展至溶菌酶的跨物種改造（VOGDB數據庫含89種裂解酶基序）及AI指導的超高通量設計（處理＞10^1?序列空間），推動噬菌體療法從經驗科學邁向可編程精準醫療時代。