看看哈佛大學怎么用“抗炎 機械”療法修復老化的肌肉

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骨骼肌老化導致肌肉質量和力量以及肌肉從受傷中恢復的能力逐漸喪失，最終損害身體表現并導致功能受限。老年患者的并發癥發生率更高、住院時間更長以及受傷后無法完全恢復功能。這種再生能力下降是由于老年肌肉干細胞行為的內在損傷以及肌肉微環境中許多與年齡相關的變化（包括免疫系統），這是肌肉修復的關鍵組成部分。免疫反應中與年齡相關的功能障礙，稱為免疫衰老或“炎癥”，會導致受傷后出現慢性炎癥狀態，并且與老年人的肌肉不良再生結果有關。

此外，由于使用手術或藥物治療老年肌肉損傷可能會受到老年患者醫療禁忌癥的限制，因此依賴于使用物理組織操作（例如按摩）的替代非侵入性療法可能會提供更安全的選擇。雖然基于機器人驅動的機械負荷 (ML) 療法（“機械療法”）可以促進嚴重骨骼肌損傷后的再生，但這種方法在衰老過程中的有效性尚不清楚，并且可能受到與年齡相關的骨骼愈合能力下降而進一步影響到肌肉恢復。

為了解決這一認知差距，來自美國哈佛大學的D. J. Mooney團隊使用了一種非侵入性、負載控制的機器人設備來施加高度定義的組織應力，以評估ML對損傷后肌肉修復的年齡依賴性。發現受傷肌肉對機器人驅動的循環壓縮載荷的反應對年齡十分敏感，這表明 ML 不僅對受傷的老年肌肉缺乏修復作用，而且還會加劇組織炎癥。單獨使用 ML 也會破壞老化肌肉干細胞的正常再生過程。然而，這些負面影響可以通過在 ML 應用的同時引入抗炎療法來逆轉，即使在老年小鼠中也會導致提升骨骼肌的再生能力。相關工作以題為“Anti-inflammatory therapy enables robot-actuated regeneration of aged muscle”的文章發表在2023年3月22日的國際頂級期刊《Science Robotics》。

1. 創新型研究內容

這項工作使用兩步過程模擬了嚴重的肌肉損傷，該過程包括肌肉注射肌毒素到脛骨前肌 (TA) 肌肉，然后誘導后肢缺血（圖 1）。肌毒素在肌纖維中誘導嚴重壞死，同時使細胞外基質完好無損并保留衛星細胞群，后肢股動脈結扎會加劇并延長損傷。本研究首先研究了年輕（2 至 3 個月大）和老年（20 至 22 個月大）動物嚴重受傷的 TA 肌肉恢復的差異。如圖 1 所示，觀察到老化肌肉的愈合能力明顯受損。受傷后 14 天，受傷的年輕肌肉產生的強直收縮力與未受傷的年輕肌肉相匹配，而即使到第 21 天，受傷的老年肌肉產生的強直收縮力也不會超過未受傷的老年肌肉的 35%。此外，在連續刺激后，與年輕肌肉相比，老年肌肉的抗疲勞性顯著降低，并且 TA 與體重的比率也較低。在結構上，在受傷后 14 天，老年肌肉比年輕肌肉表現出更高百分比的受損肌纖維和更大程度的纖維化，如在蘇木精和伊紅 (H& E) 和馬松染色后的切片結果對比，發現老化肌肉更頻繁地出現鈣化和脂肪沉積。本研究進一步對老年和年輕肌肉中的 Pax7+ 細胞進行量化，以評估損傷后肌肉干細胞的增殖反應。雖然 Pax7 由靜止肌肉干細胞（也稱為衛星細胞）表達，但它也在活化的肌肉干細胞 [也稱為生肌前體細胞 (MPC)] 上進行表達。這些 MPC 構成了在染色的肌肉切片中觀察到的 Pax7+ 細胞的大部分，并且這種染色模式與在評估肌肉干細胞對損傷的反應的其他研究中觀察到的一致。未受傷的老年肌肉和年輕肌肉中的總 Pax7+ 細胞相似；然而，與老年肌肉相比，損傷后 3 天在年輕肌肉中觀察到Pax7+ 細胞增加更多，這證明年輕 MPC 群體的增殖反應更強烈。

圖1 衰老的骨骼肌在受傷后表現出愈合受損和炎癥消退不良

本研究使用具有軟彈性界面的機器人加載裝置對受傷后肢的 TA 肌肉施加循環壓縮加載（圖 2）。致動器配備了力反饋控制，以確保在治療過程中和動物之間保持一致、可重復的加載。為了防止驅動過程中肌肉的偏轉或平移，本研究使用剛性 U 形肢體皮套支撐肢體，并用硅膠系帶固定腳踝。嚴重受傷的年輕和年老 TA 肌肉在受傷后 1 天開始接受每日 ML 治療（0.15 或 0.3 N，1 Hz，80% 占空比，10 分鐘/天）。對照動物受傷但未接受 ML 治療。這些研究中使用的負荷大小是根據先前的一項研究選擇的，該研究評估了年輕的 TA 肌肉對一系列力（0.15 至 0.6 N）的反應，這些力產生約 10 至 40% 的壓縮應變。為了選擇老年實驗組的年齡范圍并評估肌肉對負荷的反應作為年齡的函數，本研究首先評估了年輕（2 至 3 個月大）、中期未受傷組織的整體壓縮力學性能、老年（9 至 10 個月大）、老年（18 至 20 個月大）和非常老年（24 至 28 個月大）的動物。因為 TA 肌肉沒有表現出隨年齡顯著不同的體積壓縮機械性能，所以根據本研究的目標臨床人群選擇用于進一步實驗的動物年齡。具體來說，本研究使用了 20 到 22 個月大的老鼠，它們大致相當于 60 到 75 歲的人類，他們將從機器人輔助的機械療法中受益。這一選擇是根據 22 個月以上動物的有限可用性進一步選擇的。當前研究的其他加載參數（頻率、占空比和負載曲線）選自先前使用的 ML 參數范圍。在幼年動物中，經過 14 天的治療后，ML 治療導致強直收縮力和收縮速度顯著高于未治療的對照組。然而，這些對肌肉功能的有益影響并沒有隨著年齡的增長而保留下來。治療 21 天后，老年動物在 ML 治療組和未治療組之間沒有觀察到肌肉功能的顯著差異，引起的收縮力和速度仍然顯著低于受傷的年輕肌肉。在整個研究期間（總共 21 天），接受 ML 治療的受傷老年肌肉僅達到未受傷老年肌肉力量和速度的約 20%。

圖2 僅由機器人驅動的 ML 不會對受傷后的老化肌肉產生積極的治療效果

由于肌肉干細胞的激活、增殖和分化對于肌肉再生的發生至關重要，接下來本研究評估了衰老干細胞在受傷后對 ML 的反應行為。14 天內表達 Pax7+ 的細胞總數在受傷后 3 天的受傷、未治療的老年肌肉（對照）中最高，隨后下降。然而，ML 處理的肌肉在第 7 天的 Pax7+ 群體中表現出較晚的峰值，到第 14 天，ML 處理組中的總 Pax7+ 細胞仍然顯著較高，而對照組幾乎趨于未受傷水平這一基準（圖 3）。為了確定循環 Pax7+ 細胞的百分比，本研究使用增殖標記 Ki67 進行了共染色。在第14天，與對照組相比，ML治療的老年肌肉中 Pax7+ 細胞的百分比也顯著更高，對照組在該時間點不再表現出循環 Pax7+ 細胞。這些發現與圖 3中的數據一致，圖 3顯示在第 14 天，與對照組相比，ML 處理的肌肉中 Pax7+ 細胞數量仍然較高。因為損傷后觀察到的大多數 Pax7+ 細胞是開始肌生成的 MPC，本研究量化了表達 MyoD 的 Pax7+ 細胞部分，MyoD 是一種成肌細胞決定蛋白，可發出活化干細胞的肌源性承諾信號。Pax7+/MyoD+ 雙陽性細胞也在受傷后 3 天早期達到峰值，表明 MyoD 轉錄因子的早期表達，表達這兩種標記的細胞比例隨后在 ML 治療組和對照組中均下降。然而，在第3天，對照組中明顯更高比例的 Pax7+ 細胞是 MyoD+，隨后下降更快，導致到第7天，與 ML 處理組相比，對照組中這些雙陽性細胞的比例顯著降低。到第14天時，兩組中都很少有 Pax7+ 細胞能夠表達 MyoD。因為已知成肌細胞向肌細胞的轉化通常伴隨著肌細胞生成素 (MyoG) 的表達，所以本研究量化了表達 MyoG 的細胞的數量。在整個 14 天的治療中，與 ML 治療組相比，在對照組中觀察到更多數量的 MyoG+ 細胞，在第 3 天和第 14 天有顯著差異。到第 14 天時，與 MyoG+ 細胞相比，對照肌肉的 Pax7+ 細胞數量減少了 3.8 倍，而在同一時間點，在 ML 處理的肌肉中，這些細胞群之間沒有觀察到差異。這些數據表明，在用 ML 治療的受傷老年肌肉中，Pax7+ MPC 轉化為終末分化 MyoG+ 肌細胞的過程有所延遲。

圖3 ML 對老年骨骼肌中 MPC 的再生的破壞

為了評估 ML 對嚴重肌肉損傷后老年炎癥反應的影響，本研究首先使用流式細胞術分析量化受損組織內的總免疫細胞和特定免疫細胞亞群。在本團隊之前的工作中，用 ML 治療受傷的年輕肌肉導致受傷后3天組織中性粒細胞顯著減少，因此，本研究進一步將這種中性粒細胞清除與在年輕動物中觀察到的功能改善聯系起來。在這里，觀察到受傷的老年肌肉在 14 天的 ML 治療中沒有表現出組織中性粒細胞數量或動力學的任何變化（圖 4）。此外，總衰老免疫細胞 (CD45+)、衰老巨噬細胞 (CD45+/CD11b+/F4/80+) 或衰老樹突細胞 (CD45+/CD11b+/CD11c+) 的細胞數量或動力學沒有變化。在受傷的老年肌肉中，巨噬細胞亞型（M1、M2a 和 M2c）同樣不受 ML 治療的影響。本研究接下來關注了廣泛的細胞因子和趨化因子的表達，并將它們的相對表達確定為 ML 治療組與未治療對照組的比率。本研究觀察到，在受傷的年輕肌肉中，ML 在 14 天的治療中促進了許多促炎標志物的下降。然而，在受傷的老年肌肉中觀察到相反的趨勢，其中 ML 產生大多數細胞因子的增加，其中幾種表現出從第3天到第 14 天表達增加的趨勢。本研究通過評估 ML 處理動物血清中同一組炎癥標志物的表達，證實這種效應是 ML 處理肌肉的局部效應。對年輕肌肉和老年肌肉中顯著改變的因子（ML 至少上升或下降 50%）的基因富集分析表明，年輕肌肉中顯著減少的標記物主要通過 CCR 等機制參與驅動炎癥級聯反應和 CXCR 結合或細胞因子的產生，以及介導免疫細胞趨化性。相反，在老化的肌肉中，許多相同的標記物隨著 ML 而顯著增加。本研究更仔細地檢查了幾種促炎標志物，并觀察到在接受治療的受傷老年肌肉中干擾素-γ (IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α (TNFɑ) 和白細胞介素-6 (IL-6) 的 mRNA 和蛋白質水平均有所增加ML 與受傷、未治療的對照相比。還在受傷動物（對照或 ML 處理）的對側肢體（未受傷、未治療的肢體）中分析這三種促炎標志物的表達，以確定這些細胞因子的基線水平，并評估任何潛在的系統變化以響應 ML 應用于受傷的肢體。

圖4 損傷后老年肌肉和年輕肌肉中的免疫系統受 ML 的不同調節

為了檢驗 ML 誘導的老年肌肉炎癥干擾再生的假設，本研究通過全身施用 GC 曲安奈德 (TAc) 引入了抗炎治療和 ML 治療（圖 5）。在治療 14 天后，首先檢查了同一組細胞因子和趨化因子。將每日 GC 給藥與 ML 相結合，通過減少受傷組織中幾種炎癥標志物的表達，減輕了 ML 誘導的老年肌肉炎癥，其中許多在ML + GC處理的老化肌肉中的表達水平與僅用ML治療的年輕肌肉相似。對標記物進行基因富集分析，這些標記物在用 ML 治療的受傷老年肌肉中至少上升 50%，但當 ML 與 GC 治療組合時下降至少 50%。該分析揭示了涉及免疫細胞趨化性、促炎細胞因子產生和趨化因子活性的關鍵途徑，其中許多途徑在僅用 ML 治療的受傷年輕肌肉中同樣下降。本研究還評估了 GC 僅在恢復期間對老年肌肉炎癥的影響，并與僅 ML 和 ML + GC 治療進行了比較。富集分析揭示了 GC-only 和 ML + GC 組共有的幾個炎癥過程，以及一些 GC-only 獨有的炎癥過程。另外，本研究發現：結合 ML 和 GC 治療受傷的老年肌肉降低了促炎標志物 IFN-γ 和 TNFɑ 的 mRNA 和蛋白質表達水平，這些標志物在受傷后長期存在已被證明會阻礙肌肉再生。

圖5 GC 治療可改善 ML 誘導的衰老肌肉炎癥

本研究接下來評估了老年肌肉干細胞響應 ML + GC 聯合治療的行為。14 天后，與僅 ML 組相比，僅 GC 組和 ML + GC 組的 Pax7+ MPC 水平顯著降低（圖 6），Pax7+/MyoD+ 細胞數量也明顯減少。此外，與僅 ML 相比，僅 GC 和 ML + GC 組中 eMHC+ 肌纖維的百分比有所降低。與 ML-only 相比，在 ML + GC 組中觀察到主動分化肌原性前體減少和未成熟 eMHC+ 肌纖維數量減少同時出現更大、更成熟的肌纖維，這由肌纖維大小直方圖向右移動表明分布。另外，與僅 ML 而不是 ML + GC 相比，僅 GC 治療導致更成熟的肌纖維分布，這表明聯合治療比單獨 GC 治療在促進衰老肌肉再生方面更有效。用 ML + GC 治療的老年肌肉的炎癥減少、灌注增加、壞死減少和生肌分化改善促使本研究評估 ML 在 GC 介導的炎癥控制存在下是否可以改善嚴重損傷后的老年肌肉功能。治療 7 天后，本研究觀察到與未治療的對照組和僅接受 ML 治療的肌肉相比，僅 GC 組和 ML + GC 組受傷的老年肌肉的收縮力都有顯著改善。到第 14 天，ML + GC 組表現出比所有組（包括僅 GC）更高的平均收縮力和速度。此外，ML 在細胞水平上的作用仍然很明顯，因為無論是否引入 GC 治療，ML 都發現 YAP 和 MRTF-A 上升。總之，這些發現表明老年炎癥反應在損傷后老年骨骼肌再生中的抑制作用，以及通過炎癥控制減輕機器人驅動的 ML 對老年肌肉再生的負面影響的潛力。

圖6 將 ML 與 GC 介導的炎癥控制相結合可改善老化肌肉的再生結果

2. 總結與展望

總之，這項研究揭示了嚴重損傷后骨骼肌對機器人驅動的 ML 反應的重要年齡依賴性差異，并揭示了 ML 對老年肌肉再生的多重負面影響。使用炎癥控制來指導老年肌肉恢復對 ML 的反應是一個潛在的強大概念，其與老年患者群體的臨床研究高度相關。盡管 GC 治療可能伴隨一系列潛在的副作用，但在這項工作中使用GC提供了概念證明。進一步的研究應側重于使用更有針對性的藥理學輔助與 ML，以及更深入地評估 ML 在衰老肌肉中的負面作用。老年創傷是一個從機器人輔助組織再生技術中受益匪淺的醫學領域。這項工作證明了使用與年齡相關的生物變化的藥物控制作為基于機器人的治療的輔助手段的重要性，可以利用在老年人的年輕組織中觀察到的再生機器人的價值。