【原】對四種幾丁二糖的抗氧化活性進行的研究

論文名稱：

Hao, W.; Li, K.; Ma, Y.; Li, R.; Xing, R.; Yu, H.; Li, P. Preparation and Antioxidant Activity of Chitosan Dimers with Different Sequences. Mar. Drugs 2021, 19, 366.

主要內(nèi)容：

作為一種常見的海洋寡糖，幾丁寡糖（COS）已被證實具有良好的抗氧化活性。其抗氧化效果與聚合度、乙酰化程度及糖鏈序列密切相關(guān)，但具體的構(gòu)效關(guān)系尚不明確。本研究通過分離和酶解法獲得四種不同序列的幾丁二糖，并對全部四種幾丁二糖的抗氧化活性進行研究。首次揭示了幾丁寡糖序列對其抗氧化活性的影響規(guī)律：還原端氨基在清除超氧自由基和幾丁二糖還原能力方面起關(guān)鍵作用；同時發(fā)現(xiàn)完全脫乙酰化的幾丁二糖DD表現(xiàn)出最強的DPPH清除活性；而當(dāng)幾丁二糖的氨基被乙酰化后，其在清除羥基自由基方面展現(xiàn)出更優(yōu)的活性。幾丁寡糖序列研究為COS研究開辟了新路徑，更有利于其作用機制的探究。

DOI號：

https:///10.3390/md19070366

關(guān)鍵詞：

幾丁寡糖二聚體（二聚幾丁寡糖），抗氧化活性，分離，生物方法

本次閱讀目標(biāo)：

了解二聚幾丁寡糖的抗氧化活性，探索我們的二聚幾丁寡糖產(chǎn)物可能得應(yīng)用方向。

2. 研究背景

活性氧是生物體內(nèi)氧分子單電子還原的產(chǎn)物。當(dāng)活性氧濃度過高時，會對蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA造成損傷，從而導(dǎo)致機體氧化應(yīng)激狀態(tài)失衡[1,2,3]。這種氧化應(yīng)激是引發(fā)和促進多種疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素，包括心血管疾病[4]、帕金森病[5]、動脈粥樣硬化[6]、神經(jīng)退行性病變[7]以及癌癥[8]等。抗氧化劑能夠清除自由基，延緩多種慢性疾病進程，并抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。目前最常用的抗氧化劑是酚類化合物，如丁基羥基茴香醚（BHA）、二丁基羥基甲苯（BHT）、叔丁基對苯二酚（TBHQ）和沒食子酸丙酯（PG）等。然而，這些抗氧化劑都具有一定的毒性，因此人們更傾向于尋找無毒、高效且天然的抗氧化劑。

近年來，生物多糖因其無毒、易得且具有良好的抗氧化活性而受到廣泛關(guān)注。幾丁聚糖是由β-1,4連接的D-葡糖胺（GlcN，D）和N-乙酰-D-葡糖胺（GlcNAc，A）組成的線性多糖（本研究中省略單糖單元間的糖苷鍵表示，加粗大寫字母A代表N-乙酰-D-葡糖胺單元，加粗大寫字母D代表D-葡糖胺單元），具有良好的羥基自由基清除能力和亞鐵離子螯合特性。幾丁寡糖（COS）是幾丁聚糖的寡聚物，同樣是一種無毒、高效的新型抗氧化劑。幾丁聚糖和幾丁寡糖可通過分子量（MW）或聚合度（DP）、脫乙酰度（DA）、乙酰化模式（PA）及序列特征進行描述[16,17]。相比幾丁聚糖，幾丁寡糖具有更小的分子量和更好的水溶性，其抗氧化活性已被廣泛研究。前期研究表明，幾丁寡糖能有效清除DPPH自由基，并保護人胚胎肝細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷[18]；還能有效防護銅離子誘導(dǎo)的人神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激[19]。體內(nèi)實驗證實，幾丁寡糖可顯著提高大鼠總抗氧化能力和超氧化物歧化酶（SOD）活性，并顯著降低炎癥大鼠血清中丙二醛（MDA）含量。

此外，幾丁寡糖（COS）的抗氧化活性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，包括分子量（MW）/聚合度（DP）以及脫乙酰度（DA）等參數(shù)[21,22]。Marian等研究發(fā)現(xiàn)，聚合度為3-7的幾丁寡糖比聚合度為3-17和3-24的幾丁寡糖具有更好的抗氧化活性[21]。本課題組進一步研究了單一聚合度幾丁寡糖的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)低聚合度幾丁寡糖在清除羥基自由基和還原能力方面優(yōu)于高聚合度幾丁寡糖[23]。體內(nèi)實驗同樣證實，低聚合度幾丁寡糖具有更優(yōu)異的抗氧化活性：聚合度為1-5的幾丁寡糖能顯著提高高密度脂蛋白膽固醇水平，增強脂蛋白脂肪酶、肝脂肪酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性。

特別的是，即使具有相同聚合度和脫乙酰度的幾丁寡糖，仍可能因糖單元排列順序不同而存在多種異構(gòu)體，而這些異構(gòu)體的分離純化極具挑戰(zhàn)性。因此，幾丁寡糖結(jié)構(gòu)與抗氧化活性之間的關(guān)系在某種程度上仍不明確。最新研究表明，幾丁寡糖的序列結(jié)構(gòu)對其生物活性具有重要影響[28,29]，但序列差異對幾丁寡糖抗氧化活性的作用機制目前仍不清楚。

基于低聚合度幾丁寡糖更優(yōu)的抗氧化效果，本研究選取四種不同序列的幾丁二糖進行抗氧化活性研究。首先采用尺寸排阻色譜（SEC）結(jié)合酶法脫乙酰化技術(shù)制備了三種序列不同的幾丁二糖（AA/AD/DA），同時通過前期建立的離子交換色譜法獲得DD二糖。隨后通過體外抗氧化實驗系統(tǒng)比較了四種幾丁二糖的活性差異，從而揭示其構(gòu)效關(guān)系。該研究成果將為開發(fā)新型幾丁寡糖抗氧化劑提供重要理論依據(jù)。

3. 實驗結(jié)果及實驗討論

1. 幾丁質(zhì)寡聚體的制備和表征

幾丁二糖存在四種可能的序列結(jié)構(gòu)：AA、AD、DA和DD。由于這些序列在天然幾丁寡糖混合物中難以分離，而化學(xué)合成又因涉及多步保護和去保護步驟而耗時費力。本研究采用酶法脫乙酰化策略制備這些幾丁二糖異構(gòu)體：首先通過尺寸排阻色譜（SEC）分離N-乙酰化幾丁寡糖混合物（(GlcNAc)1-6）以獲得AA二糖作為后續(xù)酶解底物。通過檢測210 nm處洗脫液吸光度，我們收集到六個組分（F1-F6）。根據(jù)SEC分離原理，這些組分依次對應(yīng)：幾丁六糖（A6）、幾丁五糖（A5）、幾丁四糖（A4）、幾丁三糖（A3）、幾丁二糖（AA）及N-乙酰葡糖胺。

選擇F5組分進行電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）分析（圖2A），其主峰質(zhì)荷比（m/z）為425.18，與AA的[M+H]+離子峰理論值完全吻合，高效液相色譜檢測結(jié)果進一步證實F5為純度達(dá)98%的幾丁二糖（AA）。所獲得的AA二糖可作為酶解底物，用于制備另外兩種復(fù)雜序列的幾丁二糖（AD和DA）。

2. 幾丁聚糖二聚體的兩個異源序列的制備和表征

以AA二糖為底物，我們采用兩種幾丁質(zhì)脫乙酰酶制備了另外兩種幾丁二糖異構(gòu)體。其中，NodB脫乙酰酶特異性作用于幾丁寡糖非還原端的N-乙酰葡糖胺殘基[30]，而VcCOD脫乙酰酶則僅對非還原端第二個乙酰基團起作用[31]。通過在大腸桿菌中異源表達(dá)這兩種酶，并催化AA二糖脫乙酰化反應(yīng)，成功制備出兩種雜化幾丁二糖。

采用電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）對酶解產(chǎn)物進行分析。結(jié)果顯示，N-幾丁二糖與V-幾丁二糖具有相同的分子量，其主峰m/z 383恰好對應(yīng)AA二糖失去一個乙酰基（42 Da）后的[M+H]+離子峰。由此可推斷AA二糖經(jīng)酶解后確實發(fā)生脫乙酰化反應(yīng)生成DA或AD二糖，但具體序列結(jié)構(gòu)仍需進一步表征確認(rèn)。

圖1 衍生化V-幾丁二糖（m/z 577.16）在正離子模式下的ESI-MS/MS譜圖。m/z 374.17特征峰對應(yīng)D-amac片段（源自AD序列還原端產(chǎn)生的Y型離子）

3. 幾丁聚糖二聚體的高效液相色譜分析

在獲得全部四種幾丁二糖后，我們采用親水作用液相色譜（HILIC）對其純度進行測定。如表1所示，四種幾丁二糖的特征參數(shù)及對應(yīng)的HPLC譜圖顯示：隨著乙酰基的逐步脫除，幾丁二糖與色譜柱的親和力增強，導(dǎo)致其保留時間相應(yīng)延長。值得注意的是，DA與AD雖然分子量相同，但保留時間存在顯著差異（DA: 8.2 min; AD: 7.6 min），這再次驗證了二者為不同序列的異構(gòu)體。經(jīng)定量分析，所有四種幾丁二糖的純度均達(dá)到98%以上，滿足后續(xù)實驗要求。

4. COS 對細(xì)胞內(nèi)損傷的影響

代謝過程產(chǎn)生的超氧自由基被認(rèn)為是“初級”ROS，它可以進一步與其他分子相互作用以產(chǎn)生“次級”ROS 。它可以攻擊生物大分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸和多不飽和脂肪酸，使它們交叉鏈或斷裂，對細(xì)胞造成損害。四種幾丁聚糖二聚體的清除作用都是濃度依賴性的。AD 的活性優(yōu)于其他 AD，在 0.5 mg/mL 時清除效果超過 50%，當(dāng)濃度為 1.5 mg/mL 時達(dá)到 75.6%。同時，即使在高濃度下，DA 和 AA 的清除效果也很低。即使?jié)舛瘸^ 1.5 mg/mL，這兩種幾丁聚糖二聚體的清除效果仍低于 15%。四種幾丁聚糖二聚體的清除效果依次為 AD > DD >> DA、AA，這表明當(dāng)幾丁聚糖二聚體的還原端為氨基時，幾丁聚糖二聚體對超氧自由基的清除作用較好。

圖4 四個幾丁聚糖二聚體的超氧化物自由基的清除作用

還原端的氨基對幾丁聚糖二聚體的還原能力也至關(guān)重要。DD 和 AD 的還原能力隨濃度的增加而增加，而 DA 和 AA 的吸光度幾乎保持不變。然而，與清除超氧陰離子的能力不同的是，DD 的還原能力比 AD 強。幾丁聚糖二聚體的還原能力為 DD > AD > > DA、AA 的順序，這表明還原端的氨基在幾丁聚糖二聚體的還原能力中也起決定性作用。

圖5 四個幾丁聚糖二聚體的還原力

羥基自由基是氫氧根離子的中性形式。羥基自由基具有高反應(yīng)性，使其成為一種非常危險的自由基。所有四種幾丁聚糖二聚體的清除作用也與濃度有關(guān)。4 種幾丁聚糖二聚體的清除作用依次為 AA > DA >> AD、DD。氨基的乙酰化對于清除羥基自由基似乎很重要。DA 在高濃度下的效果明顯優(yōu)于 AD，表明還原端的乙酰基可能使活性更好。

圖6 四個幾丁聚糖二聚體的羥基自由基的清除效應(yīng)

DPPH 也是評價體外抗氧化作為穩(wěn)定有機自由基的常用指標(biāo)。然而，我們發(fā)現(xiàn)幾丁聚糖二聚體不能清除低濃度的 DPPH，除了 DD。AA、AD 和 DA 的清除效果仍然相對較低，盡管它們的濃度已達(dá)到 4 mg/mL，并且低濃度和高濃度之間看不到差異。DD 的清除效果在我們的設(shè)定濃度內(nèi)是濃度依賴性的，并顯示出良好的 DPPH 清除效果。DD 的清除效果在 4 mg/mL 時可達(dá) 64%。

圖7 四個幾丁聚糖二聚體的DPPH的清除效果

我們研究了它們的抗氧化活性，并期望揭示序列對抗氧化活性的影響并闡明結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系。我們的結(jié)果表明，幾丁聚糖二聚體中的氨基對于清除幾種自由基很重要。例如，幾丁聚糖二聚體 DD 表現(xiàn)出 DPPH 的高清除作用。其他三種幾丁聚糖二聚體的活性不是很好，但 DA 和 AD 仍然優(yōu)于 AA。這意味著幾丁聚糖二聚體對 DPPH 的清除作用主要基于它們的氨基。當(dāng)二糖中沒有游離氨基時，即使在高濃度下，也幾乎沒有清除 DPPH 的活性。至于 DA 和 AD，由于 DPPH 的空間位阻很大，可能難以接近氨基。以前的研究還表明，COS 中的游離氨基在清除自由基方面起著重要作用，這與我們的結(jié)果一致。除此之外，我們首先證明不僅氨基的存在對于清除自由基非常重要，而且氨基的位置（即序列）也起著至關(guān)重要的作用。例如，還原端氨基為（DD 和 AD）的幾丁聚糖二聚體有利于清除超氧自由基并增強幾丁聚糖二聚體的還原能力。另一方面，幾丁聚糖二聚體清除羥基自由基的能力顯示出不同的趨勢。對于羥基自由基，DA 在高濃度下的效果明顯優(yōu)于 AD，表明還原端的乙酰基使活性更好。此外，四種幾丁聚糖二聚體的清除羥基自由基效應(yīng)在 AA > DA >> AD 和 DD 的順序是高濃度的。氨基的乙酰化似乎對于清除羥基自由基很重要，這與之前關(guān)于不同乙酰化程度的 COS 抗氧化活性的報道一致。同時，四種幾丁聚糖二聚體在清除羥基自由基方面的差異實際上是這些指標(biāo)中最小的，這也表明該序列對清除羥基自由基的作用最小。

5. 結(jié)論

在這項研究中，我們分離了幾丁質(zhì)二聚體 （AA），并以 AA 為底物，通過酶解進一步制備了另外兩種幾丁聚糖二聚體 （DA 和 AD）。研究了幾丁聚糖二聚體的 4 個不同序列的抗氧化活性。最后，我們發(fā)現(xiàn) COS 的抗氧化活性不僅取決于其 DP 和 DA，還取決于其序列。一般來說，DD 具有更好的清除超氧自由基和 DPPH 的能力，也表現(xiàn)出更好的還原能力。此外，幾丁聚糖二聚體清除不同自由基的效果也不同。這可能與它們的機制有關(guān)。這些結(jié)果表明，短鏈 COS 具有很強的抗氧化活性，短鏈 COS 具有處理氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的潛在能力，有望發(fā)展成為一種天然抗氧化劑。

6. 個人總結(jié)

根據(jù)本篇文獻，幾丁寡糖二聚體有很強的抗氧化能力。因此可以考慮作為抗氧化劑應(yīng)用在多個領(lǐng)域。例如：

1. 食品與飲料：食品防腐劑，功能性食品

2. 醫(yī)藥與保健品：抗衰老與抗炎藥物，心血管保護，神經(jīng)保護

3. 化妝品與護膚品：抗衰老護膚品，美白產(chǎn)品，防曬產(chǎn)品

4. 農(nóng)業(yè)與動物飼料：植物保鮮，動物飼料

5. 材料科學(xué)與工業(yè)：塑料與橡膠，潤滑油與燃油，紡織品