【動物模型】小型豬急性二尖瓣反流模型

二尖瓣反流是由于二尖瓣結構或功能障礙或兩者兼有導致的心臟在收縮期二尖瓣瓣葉不能完全覆蓋左側房室孔，從而出現左心室血液反流進入左心房。

其以左心系統的容量負荷增加為其主要的病理生理學特點。在正常情況下，當左心室收縮時，二尖瓣關閉，左心室逐漸升高的壓力超越動脈壓而將主動脈瓣打開，左心室的血液進入主動脈。而在二尖瓣反流時，左心室收縮后血液不僅可以經過主動脈瓣口進入主動脈，還可以經過二尖瓣口進入左心房。左心房的壓力比主動脈要低，因而左心室收縮期血液流向左心房的時間要長于流向主動脈的時間反流回左心房的血液使左心房壓力升高，容積增大。而在下一次收縮前，反流回左心房的血液重新回到左心室，增加了左心室的前負荷。長期的容量負荷增加會導致左心室擴張，收縮力減低。

 本文將向您介紹一種簡單而有效的方法，以制備重度反流的豬二尖瓣反流模型。

物種信息：10月齡小型豬

體重：25-35kg

飼養：圍手術期，實驗動物被飼養在一個溫度和濕度舒適的環境中，可以自由飲用經滅菌處理的飲用水，每天喂食兩次。

1.實驗動物被右側臥位放置于手術臺，暴露左側胸部。

2.取左側胸部側切口，長度約10cm左右，逐層切開皮膚、皮下組織、肌肉組織至肋骨。

選擇在第三肋骨和第四肋骨之間行開胸手術。

3.牽開肺組織暴露心臟，切開心包暴露左心耳。在左心耳進行荷包縫合。

4.通過此荷包切一小口,長度約 0.5cm,將一個 8F 鞘插入左心房，深度為2.5cm~3.0cm。

5.鞘管后端連接壓力檢測器，測量并記錄左心房的壓力，其范圍一般為6~8mmHg。

6.繼續將鞘深入，通過二尖瓣口進入左心室。根據壓力波形及數值判斷鞘管前端的位置。當鞘管前端進入左心室時，平均壓增高為35~45 mmHg左右，同時脈壓差也明顯增高。

7. 通過鞘管將索切割器插入左心室。在心外膜超聲心動圖監測下，使用腱索切割器將二尖瓣后葉P2區和P3區的腱索切斷，直至達到重度二尖瓣反流，即二尖瓣反流束面積/左心房面積大于40%。

圖1：手術器械及手術結果圖

左圖：二尖切割器在手術中的應用

右圖：術后大體解剖顯示被切斷腱索的二尖瓣，腱索斷裂的瓣葉

Figure 1: Diagram of surgical instruments and surgical resultsLeft: Mitral cutter in surgeryRight: Postoperative gross anatomy showing the mitral valve with severed chordae tendinae and leaflets with ruptured chordae tendinae

8.退出腱索切割器，并將鞘管前端撤回左心房，待循環穩定15分鐘后再次測量左心房壓力。同時左心房壓力增加10mmHg以上，則手術成功。如果左心房壓力沒有增加10mmHg，我們再次使用超聲心動圖檢測進行相互印證，必要時重復之前的手術操作步驟，直到左心房壓力升高達到這一要求。 

9.對照組采用與實驗組相同的手術方法，但未進行二尖瓣腱索切割。然后逐層關胸，并請麻醉師鼓肺排除胸腔內殘余氣體。

術后給予實驗動物肌肉注射鹽酸哌替啶1mg/kg鎮痛治療，每天2次，持續2天，肌肉注射頭孢唑啉鈉15mg/kg抗感染治療，每天2次，持續3天，肌肉注射呋塞米利尿治療，每次10mg，每天2次，持續7天。術后口服地高辛、呋塞米、枸櫞酸鉀顆粒進行強心利尿補鉀治療1個月。每天觀察傷口情況，予碘伏消毒傷口，2周后拆線。每天對實驗動物進行雙肺聽診，以評估是否有肺水腫，必要時給予藥物加強支持治療。

手術過程一般需要重復 2-3次的腱索切割才能達到我們要求的反流程度。術后心臟解剖顯示，脫垂部位位于二尖瓣后瓣葉的 P2和 P3 區域，這與我們的預期是一致的。一般無實驗動物術后出現心力衰竭、肺水腫、傷口感染、肺部感染或其他嚴重并發癥。

心電圖

每只實驗動物在手術前和取材前被進行十二導聯心電圖檢查。術前心電圖顯示實驗組P波寬度與對照組相似。術后實驗組P波增寬，部分實驗動物出現雙峰改變

圖2：術后30個月比較實驗組和對照組的心電圖

上圖：對照組—P波高度和寬度正常

下圖：實驗組—P波增寬，呈雙峰型

Figure 2: ECG comparing the experimental and control groups at 30 months postoperativelyAbove: Control—P wave height and width were normalBottom: The experimental group—P wave was broadened and showed a bimodal pattern.

超聲心動圖

1.二尖瓣反流

實驗組所有入組的實驗動物均出現重度二尖瓣反流(RA/LAA>40%)，對照組無二尖瓣反流病例。

圖3：豬二尖瓣反流模型的超聲心動圖

a. 心尖四腔切面圖顯示血液流經二尖瓣并叫流到左心房，

?：藍色區域是反流束。

b. 二尖瓣水平的連續波多普勒顯示了全收縮反流。

c. -尖瓣反流組左心房前后徑、左右徑均顯著增加(分別為4.1cm和5.5cm)。?：擴大的左心房。

d. 對照組左心房前后徑、左右徑均正常(分別為2.6cm和3.3cm)?！?正常的左心房

Figure 3: Echocardiogram of a porcine mitral regurgitation modela. Quadruple section of the apex showing blood flow through the mitral valve and to the left atrium.? : The blue area is the regurgitant beam.b. Continuous wave Doppler at the mitral valve level showing total systolic regurgitation.c. - The anterior-posterior diameter and the left and right diameter of the left atrium were significantly increased in the C-cuspid regurgitation group (4.1 cm and 5.5 cm, respectively). ?: Enlarged left atrium.d. The anteroposterior and left diameters of the left atrium in the control group were normal (2.6 cm and 3.3 cm, respectively). ◇: Normal left atrium.

2.左心房容積和射血分數

重復測量的雙因素方差分析發現 LAV-max、LAV-min 和LAEF 存在顯著的組間差異(分別為 P<0.001，P<0.001，P=0.003)、組內差異(分別為P<0.001，P<0.001，P=0.001,)和交互作用(分別為P<0.001，P<0.001，P=0.009)。

組織病理學檢查

天狼星紅染色顯示二尖瓣反流組左心房CVF為18.1%+3.0%(圖6b，6f)，對照組為1.6%+0.2%(圖6，6e)，兩組比較有顯著性差異(P<0.05)。

這種差異是由于心肌組織反應性纖維化，表現為心肌細胞間膠原沉積增加，而不是呈現癲痕狀的修復性纖維化。

天狼星紅染色顯示纖維化，且顯示纖維化的成分主要為I型和I型膠原沉積所致。

圖4：正常組和二尖瓣反流組左心房和左心室

使用天狼紅染色后的纖維化程度的研究

對照組左心房組織在明場(a)和偏振光(e)下的圖像。

二尖瓣反流組左心房組織在明場(b)和偏振光(f)下的圖像。

對照組左心室組織在明場(c)和偏振光(g)下的圖像。

二尖瓣反流組左心室組織在明場(d)和偏振光(h)下的圖像。箭頭表示纖維化區域。

Figure 4: A study of the degree of fibrosis in the left atrium and left ventricle after Sirius red staining in the normal and mitral regurgitation groups. Images of left atrial tissue in the control group under brightfield (a) and polarised light (e). Image of left atrial tissue in mitral regurgitation group under brightfield (b) and polarised light (f). Images of left ventricular tissue in the control group under brightfield (c) and polarised light (g). Image of left ventricular tissue in mitral regurgitation group under brightfield (d) and polarised light (h). Arrows indicate areas of fibrosis.

房顫易感性試驗

在開胸房顫易感性試驗中，用高頻起搏法檢測房顫易感性，對照組中6只豬均未觀察到持續性房顫。二尖瓣反流組8只豬中有4只發生持續性房顫(圖7)。兩組間房顫易感性有顯著性差異(P<0.05)。二尖反流組平均房顫持續時間為310.9+103.8 s，對照組為 19.5+4.4s。

圖5：進行房顫易感性試驗時，右心房誘發電極記錄的心電圖。

BP:快速起搏:AF:房額心律:SR:竇性心律。

“||'表示中間部分被省略，房顫持續大于180秒為陽性。

二尖瓣反流組(a)房顫易感性陽性率為50%

正常組(b)房顫易感性陽性為 0%。

Figure 5: ECG recorded by the evoked electrode of the right atrium during the atrial fibrillation susceptibility test.BP: Rapid pacing: AF: atrial frontal rhythm: SR: sinus rhythm.'||' Indicates that the middle part is omitted, and atrial fibrillation lasting more than 180 seconds is positive.The positive rate of atrial fibrillation susceptibility in the mitral regurgitation group (a) was 50%The (b) atrial fibrillation susceptibility was 0% positive in the normal group.

（其他檢測指標：心內膜三維電生理標測）

二尖瓣反流的病理生理學研究

根據臨床需要,慢性二尖瓣反流具有更高的發病率,是研究的重點。急性二尖瓣反流模型向慢性二尖瓣反流模型的過渡需要藥物使實驗動物逐漸適應這種血流動力學的變化。因此本模型可用于檢驗術后藥物治療在急性二尖瓣反流轉變為慢性二尖瓣反流的過程中起到的作用。

手術器械研制與臨床前評價

二尖瓣反流模型對市面上可用于經導管和開胸入路的二尖瓣人工瓣膜和二尖瓣修復裝置和技術的研發和評價起到重要作用。

我們的二尖瓣反流模型包括了腱索斷裂、瓣環擴張和左心房增大，這些都是二尖瓣反流所固有的，也是器械研發和評價所必需的。此外，越來越多的心臟電生理治療器械在臨床上得到了應用，如三維標測系統、射頻消融系統、左心耳封堵系統等。這些裝置的操作要求實驗動物有相對擴大的左心房，以便于房間隔穿刺和左心房內的手術操作。我們的實驗表明，豬二尖瓣反流模型的左心房在手術后前6個月迅速擴張，可以滿足這類實驗的需要。

心肌纖維化研究

心肌纖維化是心臟疾病研究的一個重要方面。目前常用的心肌纖維化模型主要是通過增加壓力負荷、免疫損傷、缺血和高血糖等手段來建立的。然而這些模型中沒有一種是針對心房組織纖維化的，二尖瓣反流是研究這種情況的理想模型。

房顫研究

實驗表明二尖瓣反流與房顫的易感性增加有關。在相同強度的高頻電刺激下，二尖瓣反流組更容易發生房顫。如果同時使用起搏器，二尖瓣反流動物模型可以作為研究房顫的工具。先前的研究也表明，二尖反流聯合心房高頻電刺激可以延長實驗動物自主房顫的維持時間。

心力衰竭研究

豬二尖瓣反流模型可用于急性心力衰竭的研究，因為二尖瓣反流可引起血流動力學的突然變化。當反流量足夠大時，心臟不能適應這種變化，而出現急性心力衰竭。以前的報告描述了二尖瓣反流后急性心力衰竭死亡的案例，并有以這種方式建立急性心力衰竭模型的報道。

編輯：李蕊

責編：龐海寧

排版：李蕊